このプロトコルは、低ミリグラムスケールで全長のハンチンギン変異体を製造するために開発されました。これにより、HD研究者に不可欠な一貫した高品質のタンパク質が可能になります。手順を実演するのは、キュリア研究所の研究科学者であるマイケル・ハリスです。
1グラムのポリエチレンイミン25 Kを1リットルのエンドトキシン自由水に加えることから始めて、よくかき混ぜます。100ミリモルの塩酸を使用してpHを2.0に調整し、すべてのポリエチレンイミンが溶解するまで攪拌します。次に、100ミリモルの水酸化ナトリウム溶液を使用してpHを7.0に調整し、溶液を0.2マイクロメートルのフィルターに通します。
ろ過した溶液のアリコートを作り、摂氏マイナス20度で保管します。ペニシリンストレプトマイシンを添加した増殖培地中のHEK293細胞を加湿シェーカーインキュベーター内で摂氏37度、90 RPM、5%二酸化炭素で18〜24時間増殖させます。トランスフェクションの前日に、5リットルの三角フラスコ内の2リットルの増殖培地で細胞を1ミリリットルあたり約1.2 x 10の密度で6乗に希釈し、18〜24時間インキュベートします。
インキュベーションの最後に、製造元の指示に従って、自動セルカウンターを使用して細胞密度と生存率を測定します。トランスフェクションに必要なポリエチレンイミンとプラスミドの量を計算した後、ポリエチレンイミンとプラスミドを個別に100ミリリットルのPBSで希釈し、室温で5分間インキュベートします。次に、希釈したプラスミドとポリエチレンイミンを穏やかに旋回させて混合し、混合物を室温で30分間インキュベートします。
混合物を細胞培養物に加え、穏やかに旋回させて混合する。次に、細胞を24時間増殖させます。翌日、酪酸ナトリウム溶液を2ミリモルの凝集防止および消泡剤の最終濃度に1:1, 000の容量比で加え、加湿シェーカーインキュベーター内で細胞を48時間インキュベートします。
細胞の生存率と密度を測定した後、2, 000 Gで30分間遠心分離して細胞を回収し、精製前に細胞ペレットをマイナス80°Cで保存します。FPLCを用いた抗FLAG精製は、バッファーAを用いて12〜25ミリリットルのアンチフラッグ樹脂を毎分4ミリリットルの流量で空のカラムに充填し、プランジャーの高さを調整してプランジャーの端と樹脂床の間の隙間を取り除きます。次に、解凍した細胞ペレットを冷溶解バッファーに懸濁し、細胞懸濁液を1,000ポンド/平方インチの圧力で高剪断ホモジナイザーに1回通します。
互換性のある固定角度ローターを備えた遠心分離機を使用して、20, 000 Gで1時間溶解液を清澄化します。メソッドウィンドウでFPLCをプログラムし、サンプルポンプを介して清澄化されたライセートをロードし、テキスト原稿に記載されているように、目的のカラム容量のバッファーA、B、C、D、および溶出バッファーでカラムを洗浄します。実行が終了したら、SDS-PAGEを使用して10マイクロリットルのピークフラクションを分析します。
ピーク画分を目的の純度と組み合わせ、SDS-PAGE分析のために約50マイクロリットルの溶出液を節約します。FPLCを使用してSECカラムの平衡化を開始し、50ミリリットルのスーパーループを介してアンチフラッグ溶出液をロードします。SECバッファを実行した後、SEC分離を摂氏4度で一晩行います。
溶出プロファイルを標準のHTT溶出プロファイルと比較して、モノマー、二量体、および高次オリゴマーピークを区別します。SECカラムの溶出プロファイルに基づいて単量体HTT画分をプールし、必要に応じて、高次オリゴマーおよび二量体HTT画分を別々にプールします。プールされたHTTタンパク質を、摂氏4度で100キロダルトンの遠心濃縮器を使用して濃縮します。
タンパク質濃度を計算した後、精製HTTタンパク質を100マイクロリットル未満をクライオセーフマイクロ遠心チューブに分注します。液体窒素を使用してアリコートを瞬間凍結し、摂氏マイナス80度で保管します。UV検出器、マルチアングル光散乱検出器、示差屈折率検出器と組み合わせて、HPLCシステムで摂氏4度ですべての分析SEC-MALSを実行し、HTTの屈折率増分として0.185を使用します。
ろ過されたHPLCグレードの水でポンプと検出器をパージし、UHPLCカラムをシステムに接続します。すべての検出器信号がベースラインに達するまで、カラムをろ過水で平衡化してからSEC-MALSバッファーで平衡化します。2マイクロリットルのBSA溶液を毎分0.3ミリリットルの流速で15分間注入します。
BSA プロファイルに基づいてデータ品質を検査し、正規化、ピークアライメント、およびバンド拡大補正を実行し、次の HTT サンプル実行のテンプレートを作成します。フロートを使用して、室温の水浴中でFL Q23-HTTサンプルのバイアルを素早く解凍します。HTTを0.1マイクロメートルのスピンフィルターでろ過します。
2〜4マイクロリットルのHTTサンプルを注入し、毎分0.3ミリリットルの流速で摂氏4度で15分間実行します。付属のソフトウェアを使用してクロマトグラフィーおよび光散乱データを分析し、Zimmプロットを生成して、各ピークの重量平均分子量を決定します。本研究では、2段階のカラムプロセスを使用して、HTTの純度が95%を超え、主要な汚染物質はシャペロンHsp70であり、抗FLAGアフィニティー精製ステップ中に塩化マグネシウムとATPによる広範な洗浄によって除去されました。 FL HTTの過剰発現はタンパク質の断片化を引き起こす可能性がありますが、正しい分子量350キロダルトンの単一バンドとして分離された方法で生成されたFL Q23-HTTは、フラグメンテーション。
抗体とFL Q23-HTTとの反応後のウェスタンブロット分析は、追加のフラグメント関連バンドが観察されなかったため、有意な検出可能な切り捨てなしにタンパク質が単離されたことを示しました。FL HTTポリQ長分散、Q23、Q48、およびQ73は、ウェスタンブロットで予想どおりに反応し、ポリQ指向モノクローナル抗体MW1に対して漸進的に強いシグナルを示し、Q長の増加と相関しました。テストしたHPLCカラムの中で、SECカラムはHTTモノマーとダイマーの間で十分な分離能を示し、モル質量を区別できました。
SECの精製FL HTTは、オリゴマー化状態に対応する複数のバンドを示しましたが、これは、ゲル内の移動中に高次オリゴマーの形成に寄与するいくつかの疎水性パッチの存在による可能性があります。精製HTTは、青色のネイティブPAGE上に、推定分子量643、927、および1, 070キロダルトンの3つの主要なバンドを示し、それぞれHTTの単量体、二量体、および三量体種を表す可能性が高い。精製されたハンチンチンの適切な取り扱いは、可溶性凝集体中に高次オリゴマーを生成することを避けるために不可欠です。
エンドユーザーは、瞬間凍結する前に、サンプルを事前に冷却されたチューブに分注するために迅速に作業することが不可欠です。長期安定性試験は、摂氏マイナス80度で長期間保管されたサンプルに対して実行できます。HPLC SEC-MALS分析を繰り返すと、サンプルのモノマー含有量に変化があったかどうかを確認します。
