私たちは、この仕事とレスターコアテクノロジー·サービス大学のために使用される発現構築物を調製するための博士孝文ヤン（PROTEXクローニングサービス）を感謝したいと思います。この作品は、BBSRCの学生の身分によってサポートされていました、ウェルカムトラストプログラムとシニア調査官補助金WT085408＆WT100237とBBSRCはRM31G0224を付与します。

注：プロトコルは、そのための試薬のボリュームと量が比例的にスケールされるべきである、式の任意のスケールに適しています。適切な哺乳動物発現ベクターは、このプロトコルを使用しなければならない。ここでは、便利なクローニング（ 図1）で使用される制限酵素の選択に応じて親和性タグの包含または除外することができ変更されたpcDNA 3.1発現ベクターを使用していました。以下のプロトコルは、大規模なトランスフェクションについて説明します。 1Lのローラーボトル中で1大規模文化/トランスフェクション標準的なプロトコルに従ってHEK293F懸濁適応細胞を成長させ、維持する。典型的には30〜100 mLのスターター培養物を250 mlコニカル細胞培養フラスコ中で増殖させる。 <ol><li>各1リットルのローラーボトル300 mlの最終体積中に0.5×10 6細胞/ mlの種子細胞。 注：ローラーボトルは、最大に150ミリリットルの最小値を受け入れる懸濁培養を300ml。より大規模なトランスフェクションのために複数のボトルを使用しています。 </li><li>細胞は1.0×10 6細胞/ mlの密度に達するまで、37℃でオービタルシェーカーインキュベーター内で24時間、120rpmで、5％CO 2でインキュベート（細胞が約24時間ごとに分割します）。 </li><li>ろ過滅菌したDNAの300μgの合計ピペット3秒間激しくPBS 30mlおよび渦に（補助メソッドを参照してください）​​。 注：百トランスフェクションされた細胞あたり1μgのDNAの合計を使用してください。二つ以上のプラスミドをする同時トランスフェクトされた場合細胞に対するDNAの比が一定となるようにそれぞれの量を減らす。 </li><li> 3秒間、PBS / DNA溶液激しく渦に0.5 mg / mlのフィルター滅菌PEIの1.2ミリリットルを追加します。 </li><li> 20分間RTでミックスをインキュベートする。 </li><li> 1×10 6細胞/ ml（ステップ1.3）の密度であるべきである- DNA / PEIを細胞に混ぜ入れる。 </li><li>同時トランスフェクションの後、細胞をインキュベートさらに37℃で48時間、120 rpmで、5％CO 2、オービタルシェーカーインキュベーター中。 </li><li> 5分間3000×gで細胞を遠心分離することによって細胞内タンパク質を収穫し、-80℃でペレットを格納します。 注：上記の培養雰囲気がCO 2 5％で置き換え、そしてボトルの蓋が密閉されている場合あるいは、振盪インキュベーター標準（非CO 2）を使用。雰囲気は各継代（通常は2日ごと）に交換する必要があります。 </li></ol>全細胞抽出物から2タンパク質複合体精製このプロトコルは、フラグ標識タンパク質を用いた核複合体の精製のために最適化されています。 <ol><li>あらかじめ冷却溶解緩衝液（100mM酢酸カリウム、50mMトリスpH7.5で、5％グリセロール、0.3％トリトンX-100、プロテアーゼ阻害剤）の培養物1Lあたりの約40中への細胞ペレットを解凍。 </li><li>再懸濁（ボルテックス、発泡を避けるためにしないでください）​​上下にピペッティング数倍ペレットを。 </lI&gt; <li>完全にガラスホモジナイザーを用いて細胞を再懸濁。 3サイクル（15秒、15秒オフ）のために超音波処理。 4℃で25分間30,000×gで遠心分離し、上清を保持している。 </li><li>樹脂の平衡化緩衝液（100mM酢酸カリウム、50mMトリスpH7.5）で3回洗浄することによって培養物のリットル当たり抗フラグパックアガロース樹脂1.25mlの平衡。 </li><li>一つ以上の50ml遠心チューブ中の親和性樹脂と歩調2.3からの全細胞抽出物をインキュベートし、穏やかに、4℃で30〜120分間、サンプルを回転させる。 </li><li> 4℃、廃棄上澄みで1分間3000×gで遠心分離します。 </li><li>予め冷却した緩衝液45mlを1（100mM酢酸カリウム、50mMトリスpH7.5で、5％グリセロール、0.3％トリトンX-100）で樹脂を洗浄する。 1分間3000×gで遠心分離し、上澄みを捨てる。 </li><li>高塩緩衝液を用いて手順を繰り返し2.7低塩緩衝液（50mMの酢酸カリウム、50 mMトリスpHを7に続く（300 mMの酢酸カリウム、50mMトリスpH7.5で、5％グリセロール）0.5、5％グリセロール）及びTEV切断緩衝液（50mMの酢酸カリウム、50mMトリスpH7.5の、0.5 mMのTCEP）。 注：各洗浄は、すなわち完全にもはや樹脂を再懸濁し、するのに十分短いことを確認します。 </li><li>樹脂の10μlのサンプルを収集し、分析のために2倍のタンパク質ローディングバッファー（結合したタンパク質制御）の1体積中に希釈する。樹脂から抗体を解放する避けるために還元剤を使用しないでください。 </li><li> 15mlの遠心管にあらかじめ冷却TEV切断バッファーと転送8-10中へ樹脂を再懸濁する。 </li><li>追加〜40元の培養1L当たり（1 mg / mlの時ストックから）TEVプロテアーゼμgの上下に数回ピペッティングしてよく混ぜます。 </li><li>タンパク質の酸化を防止するために、100％のN 2ガ ​​スでチューブ雰囲気を交換してください。 </li><li>静かに、4℃でO / N回転させます。 </li><li> 10分間の3000×gで遠心分離します。適切な分子量カットオフの超遠心フィルターに上清を移し、集中500μlのまで。 </li><li>濃縮されたタンパク質の10μlのサンプルを収集し、分析のために2倍のタンパク質ローディングバッファーの1の体積に希釈する。 （TEVは、コントロールを溶出）。 </li><li>樹脂の10μlのサンプルを収集し、分析のために2倍のタンパク質ローディングバッファー1体積中に希釈する。樹脂から大量の抗体を解放しないようにするために、還元剤は使用しないでください。 （ポスト-TEV樹脂制御）。 </li><li>ゲルろ過バッファー（50mMの酢酸カリウム、50mMトリスpH7.5の、0.5 mMのTCEP）でのサイズ排除クロマトグラフィーカラムを平衡化する。 </li><li> 0.22μmのフィルターに通してタンパク質をフィルター</li><li>カラムに試料をロードし、画分を収集します。 </li><li>ステップ2.9、2.15と2.16と分析のためのSDS-PAGEおよびクーマシー染色の手順2.19からゲル濾過分画から実行サンプル。 注：それは、標的タンパク質の発現を確認するためのステップ2.9、2.15および2.16以前のゲル濾過からのサンプルのSDS-PAGEを実行することをお勧めします。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Baneyx, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+protein+expression+in+Escherichia+coli.">Recombinant protein expression in Escherichia coli.</a> Current opinion in biotechnology. 10 (5), 411-421 (1999).</li><li>Aricescu, A. R., Owens, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+recombinant+glycoproteins+in+mammalian+cells:+towards+an+integrative+approach+to+structural+biology.">Expression of recombinant glycoproteins in mammalian cells: towards an integrative approach to structural biology.</a> Current opinion in structural biology. 23 (3), 345-356 (2013).</li><li>Kim, T. K., Eberwine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+cell+transfection:+the+present+and+the+future.">Mammalian cell transfection: the present and the future.</a> Analytical and bioanalytical chemistry. 397 (8), 3173-3178 (2010).</li><li>Boussif, O., Zanta, M. A., Behr, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+galenics+improve+in+vitro+gene+transfer+with+cationic+molecules+up+to+1000-fold.">Optimized galenics improve in vitro gene transfer with cationic molecules up to 1000-fold.</a> Gene therapy. 3 (12), 1074-1080 (1996).</li><li>Godbey, W. T., Wu, K. K., Mikos, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poly+(ethylenimine)+and+its+role+in+gene+delivery.">Poly (ethylenimine) and its role in gene delivery.</a> Journal of Controlled Release. 60 ((2-3)), 149-160 (1999).</li><li>Beljelarskaya, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baculovirus+expression+systems+for+production+of+recombinant+proteins+in+insect+and+mammalian+cells.">Baculovirus expression systems for production of recombinant proteins in insect and mammalian cells.</a> Molecular Biology. 45 (1), 123-138 (2011).</li><li>Cregg, J. M., Vedvick, T. S., Raschke, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+the+expression+of+foreign+genes+in+Pichia+pastoris.">Recent advances in the expression of foreign genes in Pichia pastoris.</a> Nature Biotechnology. 11 (8), 905-910 (1993).</li><li>Watson, P. J., Fairall, L., Santos, G. M., Schwabe, J. W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+HDAC3+bound+to+co-repressor+and+inositol+tetraphosphate.">Structure of HDAC3 bound to co-repressor and inositol tetraphosphate.</a> Nature. 481 (7381), 335-340 (2013).</li><li>Millard, C. J., Watson, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Class+I+HDACs+Share+a+Common+Mechanism+of+Regulation+by+Inositol+Phosphates.">Class I HDACs Share a Common Mechanism of Regulation by Inositol Phosphates.</a> Molecular Cell. 51 (1), 57-67 (2013).</li><li>Tom, R., Bisson, L., Durocher, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+of+HEK293-EBNA1+Cells+in+Suspension+with+Linear+PEI+for+Production+of+Recombinant+Proteins.">Transfection of HEK293-EBNA1 Cells in Suspension with Linear PEI for Production of Recombinant Proteins.</a> CSH protocols. , pdb.prot4977 (2008).</li><li>Durocher, Y., Perret, S., Kamen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-level+and+high-throughput+recombinant+protein+production+by+transient+transfection+of+suspension-growing+human+293-EBNA1+cells.">High-level and high-throughput recombinant protein production by transient transfection of suspension-growing human 293-EBNA1 cells.</a> Nucleic Acids Research. 30 (2), (2002).</li><li>Baldi, L., Muller, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+Gene+Expression+in+Suspension+HEK&#8208;293+Cells:+Application+to+Large&#8208;Scale+Protein+Production.">Transient Gene Expression in Suspension HEK&#8208;293 Cells: Application to Large&#8208;Scale Protein Production.</a> Biotechnology Progress. 21 (1), 148-153 (2005).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

私たちは、哺乳動物細胞から組換えタンパク質及び多サブユニット複合体を大量に発現させ、精製するために（PEIは、市販の親油性のトランスフェクション試薬よりもはるかに少ない費用）簡単かつコスト効果的な方法を開発した。プロトコルセクションに記載したように、高純度のプラスミドDNA（1.8と2.0との間の280分の260）はPEIと組み合わせて使用​​される場合、最適なトランスフェクションおよび発現効率に達することができる。細胞を血清および抗生物質を含まない培地で培養されなければならないので、滅菌技術は厳密にコストと時間がかかる感染症を避けるために継代し、細胞をトランスフェクトするために必要とされる。細胞の生存率が90％以上でなければならず、文化が2.5×10 6個の細胞よりも大きな密度まで成長させることはありません/すぐにトランスフェクションの前に、そうするように、タンパク質収量が減少しますミリリットル。成功したトランスフェクションのために、培養物を単一または分裂細胞にのみ含まれている必要があります。クラスタは活力によって分割することができるOUはボルテックス20〜30秒（ 図5）。同時トランスフェクションに用いた各プラスミドの比率が研究され、複合体の化学量論に従って、ユーザによって変更することができる。適切な発現時間を確立することができるように、発現効率は、目的のタンパク質に対して最適化することができる。精製は、望ましくないタンパク質分解の危険性を減らすために常時冷たいタンパク質試料を保持行われるべきである。彼らはしばしば減少溶解性および/または酵素活性の損失をもたらす、構造要素または特定のタンパク質の活性部位を妨害することがあるので、タグ及び精製緩衝液の選択は、重要である。小規模トランスフェクションは、大きなタンパク質複合体の精製のための異なる構築物を試験するために特に有用である。 今日では、代わりの方法論の多種多様な組換え真核生物のタンパク質（ 表2）の発現のために利用可能である。たとえば、Baculovi昆虫細胞におけるコーラス発現は広く、その高い形質導入効率および他のウイルス種6と比較して細胞毒性の欠如に使用される。しかし、ウイルスを作製するプロセスは、時間がかかり、その不安定性は、ウイルスが長期間保存することはできません。一方、酵母発現系は、高いタンパク質収率7で得られた、増殖する細胞の発酵槽培養物における非常に高い密度の可能性を提供する。しかし、彼らはまだ、真核生物のタンパク質が正しく折り畳まおよびそれらのタンパク質パートナーと相互作用することに必要な翻訳後修飾の完全な多様性を欠いている。 HDAC3は、例えば、発現されるが、Eにフォールドしない大腸菌 。 293F細胞内で発現した場合しかし、私たちはそのプレッサー（SMRT）および原核細胞には見られない、イノシトール四リン（IP4）8の分子との複合体中の活性酵素を精製することができました。また、このメソッドは、STを精製し、結晶を解決するために私達を許可している同様IP4 9によって活性化されるNuRD複合体でMTA1との相互作用HDAC1のructure。理想的には、私たちは常にその自然、生理的環境における真核生物のタンパク質を表したいと思います。バイオリアクター10-12にHEK 293-EBNA1細胞を用いた哺乳動物発現系が記載およびタンパク質の非常に高いレベルをもたらすが、これらは使用するのが複雑であることができるされている。 本手法は、細菌、酵母およびバイオリアクター系における発現への簡単アクセス可能な代替手段です。表現方法は、高速であり、ローラーボトルまたはフラスコの雰囲気は、5％CO 2で置換されている、標準的な振とうインキュベータが使用される場合は特に、高価な機器の使用を必要としない。私たちは、複数のプラスミドトランスフェを共同文化の&gt; 1 mg / Lの収率で最大5つのタンパク質と複合体を精製するために、これらのプロトコルを使用している。興味深いことに、システムは安定行儀複合体の識別を支援します。たとえば、元HDAC1とSin3Aの二元複合体のpressionは、タンパク質の制限された収量を与え、まだSDS3の追加は、5倍高い量をもたらし、したがって、結晶化に適した構築物および安定な複合体の選択における構造生物学者を案内する。

分子細胞生物学の急速な進歩と医療における改善された薬物についての一定の必要性は、構造生物学者は、ますます複雑なタンパク質の構造を見てする必要性を作成しています。これらは、しばしば、その精巧なフォールディングおよび酵素活性をサポートするために特定の翻訳後修飾、分子シャペロン、および補因子を必要とし得る。タンパク質データバンクに存在する構造体の大部分は、細菌発現系を用いて得られている一方で、原核生物は、これらの修飾の多数を実行することができず、多くの必須の真核生物の補因子を欠いている。これは、小さなシグナル伝達分子によってだけでなく、核、細胞表面や精巧な折りたたみ式機械を必要とする分泌タンパク質のために活性化される大きなマルチサブユニット複合体の研究のために問題となることがあります。 Eの数大腸菌株は、これらの制限1のいくつかを克服するように操作されている。 mが、近年では、しかし、使用ammalian発現系は、それらが確実に他のシステム2で表現する他の方法で問題となる真核生物のタンパク質を産生するために増加している。今日では、化学物質媒介トランスフェクション、ウイルス形質導入の範囲のさまざまな技術を通じて安定かつ一過性の哺乳動物発現細胞株を得るために、そのようなエレクトロポレーションおよび直接噴射3のような物理的遺伝子導入が可能である。これらの方法の全ては、長所と短所の独自のセットを有するが、それらのほんの数は、構造研究があまりにも高価および/または時間を消費するのいずれかであるのに適している。 ここでは、非常に、シンプルで高速、安価なまだサスペンション成長し、哺乳動物細胞における構造生物学のためのタンパク質複合体を発現させるための非常に効率的な方法を説明します。アプローチは、ヒト胎児腎臓（HEK）細胞株（ 例えば、フリースタイル、HEK 293F細胞）の一過性同時トランスフェクションを使用しています。これらの細胞は、HEK 293 CEから誘導されているllのラインは、（例えば、フリースタイル293発現培地など）を、無血清培地を用いて高密度に達し、懸濁培養中で増殖するように適合されている。次いで、細胞を一過性ポリエチレンイミン、分枝バージョン（PEI）、エンドサイトーシス5によって宿主細胞に入るDNA / PEI複合体を形成することによって、哺乳動物細胞4の広い範囲のために機能することが報告されている安価なポリマー試薬を用いてトランスフェクトされる。この方法は、（300ミリリットルまで）小規模（30ml）および大規模の両方に適しており、実験および精製されたタンパク質複合体を高レベルで生成することができる。これは、複雑な折り畳み機械、細菌、酵母、および昆虫細胞によって行うことができない補因子、または特定の翻訳後修飾を必要とするタンパク質を研究するために特に有用である。 このプロトコルでは、Sin3A転写抑制複合体からの3タンパク質中央足場の発現および精製を提示する。これはヒストンで構成されていデアセチラーゼ1（HDAC1）、不良サイレン3（SDS3）のサプレッサーおよびスイッチに依存しない3（Sin3A）。精製された複合体は、ハイスループット結晶化試験のために使用される。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="865">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:140px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:292px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FreeStyle HEK 293F cells&#160;</td>
			<td style="width:140px;">LifeTechnologies</td>
			<td>R790-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:315px;">FreeStyle 293 Expression Medium</td>
			<td style="width:140px;">LifeTechnologies</td>
			<td style="width:119px;">12338-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Anti-FLAG M2 Affinity Gel</td>
			<td style="width:140px;">SIGMA</td>
			<td style="width:119px;">A220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:315px;">250 ml Erlenmeyer Flask with Vented Cap</td>
			<td style="width:140px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">431144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Roller bottles with vented caps</td>
			<td style="width:140px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">01836-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:315px;">Polyethylinamine, 25 kDa, branched</td>
			<td style="width:140px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">408727</td>
			<td style="width:292px;">Make 0.5 mg/ml stocks in H2O, adjust pH to 7.0 with dilute HCl and store at -20 - 4&#186;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Mammalian expression vector</td>
			<td style="width:140px;">-</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline (DPBS)</td>
			<td style="width:140px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">0.22 &#181;m Centrifugal Filter Units</td>
			<td style="width:140px;">Amicon</td>
			<td style="width:119px;">UFC30GV00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">15 ml Ultra centrifugal filters (10 kDa cut-off)</td>
			<td style="width:140px;">Amicon</td>
			<td style="width:119px;">UFC901008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:315px;">Superdex&#160; 10/300 GL</td>
			<td style="width:140px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">17-5175-01</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

recombinant protein expression for structural biology in hek 293f suspension cells: a novel and accessible approach

The expression and purification of large amounts of recombinant protein complexes is an essential requirement for structural biology studies. For over two decades, prokaryotic expression systems such as E. coli have dominated the scientific literature over costly and less efficient eukaryotic cell lines. Despite the clear advantage in terms of yields and costs of expressing recombinant proteins in bacteria, the absence of specific co-factors, chaperones and post-translational modifications may cause loss of function, mis-folding and can disrupt protein-protein interactions of certain eukaryotic multi-subunit complexes, surface receptors and secreted proteins. The use of mammalian cell expression systems can address these drawbacks since they provide a eukaryotic expression environment. However, low protein yields and high costs of such methods have until recently limited their use for structural biology. Here we describe a simple and accessible method for expressing and purifying milligram quantities of protein by performing transient transfections of suspension grown HEK (Human Embryonic Kidney) 293F cells.

ここでは、HDAC1、SDS3、Sin3A三元複合体の2 L（8×250ミリリットル培養）一過性の同時トランスフェクションおよび精製を示している。 HDAC1とSDS3はSin3AのHDAC-相互作用ドメイン（HID）を介してSin3Aと対話します。文化リットル当たり複雑な1mgのまでの典型的な精製収量。 <img alt="図1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51897/51897fig1highres.jpg" width="500" /> 修飾されたpcDNA 3.1発現ベクターの図1の模式図。プラスミドをSin3Aのアミノ末端上のアフィニティータグおよびTEV切断部位を含むようにEcoRVおよびEcoRIで消化し ​​た。 HDAC1とSDS3のタグなしバージョンのクローンを作成するには、ベクターは、KpnIとEcoRIで消化した。 <img alt="図2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51897/51897fig2highres.jpg" width="500" /> 図2のSDS-PAGE精製の ​​第一段階を示す。「結合タンパク質」レーンは、親和性樹脂に結合した複合体を示している。 TEV消化後、Sin3A-HID上に存在するタグが切断されると、ゲルの第二および第三のレーンに示すように、複合体は、樹脂から溶出される。 <img alt="図3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51897/51897fig3highres.jpg" width="500" /> タンパク質複合体のサイズ排除クロマトグラフィーを用いて精製する図3クロマトグラムは、溶液中で二量体を形成するので、純粋な複合体は空隙容量に溶出されることに注意してください。 <img alt="図4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51897/51897fig4highres.jpg" width="500" /> 図3に示すゲル濾過画分を示す図4のSDS-PAGE。 図2.3×10 6個/ mlで5トリパンブルー染色HEK 293F細胞に形質移入することができる状態に。大規模なクラスタを約25秒間激しくボルテックスによって分割されてもよい細胞は、唯一、単一または分裂細胞として存在すべきである。 <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> 問題 </td><td> 考えられる原因 </td><td> アクション </td></tr><tr><td rowspan="4">低タンパク質収量。 </td><td>トランスフェクションされた細胞の数が少ない。 </td><td>必ず細胞密度が1.0×10 6培養物にトランスフェクション反応混合物を添加する前に約あることを確認してください。 </td></tr><tr><td>細胞は、何度も継代培養された可能性があります。 </td><td>約90パスの後、新鮮な株式細胞を使用して、年齢。 </td></tr><tr><td> DNAの分解又は不純物を多量に有してもよい。 </td><td>使用されているプラ​​スミドDNAが1.8と2.0の間260/280比を有することを確認してください。アガロースゲル上でDNAを実行すると、その品質を評価することをお勧めします。 </td></tr><tr><td>タンパク質（複数可）を発現している安定したか十分に溶解しない。 </td><td>トランスフェクションのスケーリングアップする前に、小スケールでの異なる構築物をテストします。必ずタグは、目的のタンパク質（単数または複数）の構造に干渉しないことを確認します。 </td></tr><tr><td>細胞は曇って見え、珍しい色および/または臭気を持つ。 </td><td>細胞は、細菌や酵母に感染している。 </td><td>グッド無菌技術は常に使用する必要があります。層流フードや感染症の場合には、UV-消毒細胞培養室を燻蒸すると、問題を含むことができます。 </td></tr><tr><td rowspan="2">細胞は、低い生存率を持っている。 </td><td>メディアでの間違ったpH値。 </td><td>培養はCO 2百分の5から8で成長していることを確認してくださいすべての回で。 </td></tr><tr><td>細胞は3.0×10 6細胞/ mlの上に密度まで培養した。 </td><td>細胞は、2.5×10 6細胞/すぐにトランスフェクションの前に、決して3.0×10 6個 / mlを超えるミリリットル以上の密度にまで成長させることがないようにしてください。 </td></tr><tr><td rowspan="2">アフィニティー精製は動作しませんでした</td><td>タンパク質は、（複数の）発現されていない。 </td><td>上記を参照してください。 </td></tr><tr><td>精製条件は、間違っているかもしれない。 </td><td>緩衝条件の調整（ 例えば、高塩、低塩、pHが。） </td></tr></tbody></table> 表1のトラブルシューティング。 <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> システム </td><td> メリット </td><td> デメリット </td></tr><tr><td> E.コリ </td><td><ul><li>ファスト発現系</li><li>高タンパク質収率</li><li>安価な</li><li>同位体標識されたタンパク質の手頃な価格の製造に適した</li></ul></td><td><ul><li>タンパク質の折りたたみのために必要となる場合があります重要なシャペロンの欠如</li><li>多くの翻訳後修飾の欠如</li><li>タンパク質の機能および/または複雑なアセンブリのために重要である補因子を欠いていてもよい。 </li></ul></td></tr><tr><td> P.パストリス </td><td><ul><li>翻訳後修飾の大部分を実行することができます</li><li>安価な</li></ul></td><td><ul><li>いくつかの翻訳後修飾を欠いている</li><li>タンパク質の機能および/または複雑なアセンブリのために重要である補因子を欠いていてもよい。 </li></ul></td></tr><tr><td> 昆虫細胞中でバキュロウイルス発現 </td><td><ul><li>すべての翻訳後修飾を行うことができます&lt;/李&gt; <li>バキュロウイルスは、他のウイルス株よりも少ない細胞毒性である</li></ul></td><td><ul><li>形質導入のためのウイルスの準備時間がかかり</li><li>ウイルスは安定ではなく、長期間保存することができない</li><li>昆虫細胞は、タンパク質の機能および/または複雑なアセンブリのために重要である補因子を欠いていてもよい。 </li></ul></td></tr><tr><td> 哺乳動物系でバイオリアクター </td><td><ul><li>すべての翻訳後修飾を行うことができます</li><li>タンパク質機能及び複雑なアセンブリに必要な全ての補助因子を提供することができ</li><li>非常に高い密度で缶は、培養細胞</li><li>複雑なフォールディング機械を必要とするすべての哺乳動物タンパク質を発現することができる</li><li>非常に高いタンパク質収率</li></ul></td><td><ul><li>バイオリアクターを使用するために専門スタッフが必要です。 </li><li>高価な機器が必要です。 </li><li>最適発現条件sは、時間を消費することができる。 </li></ul></td></tr><tr><td> HEK 293F懸濁細胞 </td><td><ul><li>すべての翻訳後修飾を行うことができます</li><li>タンパク質機能及び複雑なアセンブリに必要な全ての補助因子を提供することができ</li><li>複雑な折りたたみ機構を必要とするすべての哺乳動物タンパク質を発現することができる</li><li>高速かつ直感的なトランスフェクションプロトコール</li><li>バイオリアクターおよび/または他の市販のトランスフェクション試薬に比べて比較的安価。 </li></ul></td><td><ul><li>細菌での発現はできるだけ安く、手頃な価格ではないが、 </li></ul></td></tr></tbody></table> 表2の利点と主な発現システムの欠点。

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Recombinant Protein Expression for Structural Biology in HEK 293F Suspension Cells: A Novel and Accessible Approach

The expression of recombinant proteins by mammalian systems is becoming an attractive method for producing protein complexes for structural biology. Here we present a simple yet highly efficient expression system using suspension grown mammalian cells to purify protein complexes for structural studies.

HEK 293F懸濁細胞における構造生物学のための組換えタンパク質の発現：小説とアクセアプローチ

The expression and purification of large amounts of recombinant protein complexes is an essential requirement for structural biology studies. For over two ...

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Biology

53.3K ビュー.  University of Leicester. The expression of recombinant proteins by mammalian systems is becoming an attractive method for producing protein complexes for structural biology. Here we present a simple yet highly efficient expression system using suspension grown mammalian cells to purify protein complexes for structural studies.

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A Method For Production of Recombinant mCD1d Protein in Insect Cells.

CD1 proteins constitute a third class of antigen-presenting molecules. They are cell surface glycoproteins, expressed as approximately 50-kDa glycosylated heavy chains that are noncovalently associated with beta2-microglobulin. They bind lipids rather than peptides. Although their structure confirms the similarity of CD1 proteins to MHC class I and class II antigen presenting molecules, the mCD1d groove is relatively narrow, deep, and highly hydrophobic and it has two binding pockets instead of the several shallow pockets described for the classical MHC-encoded antigen-presenting molecules. Based upon their amino acid sequences, such a hydrobphobic groove provides an ideal environment for the binding of lipid antigens. The Natural Killer T (NKT) cells use their TCR to recognize glycolipids bound to or presented by CD1d. T cells reactive to lipids presented by CD1 have been involved in the protection against autoimmune and infectious diseases and in tumor rejection. Thus, the ability to identify, purify , and track the response of CD1-reactive NKT cell is of great importance . The generation of tetramers of alpha Galactosyl ceramide (a-Galcer) with CD1d has significant insight into the biology of NKT cells. Tetramers constructed from other CD1 molecules have also been generated and these new reagents have greatly expanded the knowledge of the functions of lipid-reactive T cells, with potential use in monitoring the response to lipid-based vaccines and in the diagnosis of autoimmune diseases and other treatments.

A Method to prepare Insect cells and infect them with baculovirus for the the purpose of production of recombinant mCD1d proteinand generating mCD1d tetramers.

昆虫細胞における組換えmCD1dタンパク質の製造方法。

CD1 proteins constitute a third class of antigen-presenting molecules. They are cell surface glycoproteins, expressed as approximately 50-kDa glycosylated ...

生物学

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

クーマシー有機溶媒および酢酸のないG - 250でゲル中のタンパク質の染色

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

ナマルバ細胞におけるIL - 4依存性遺伝子発現のsiRNAのノックダウン：遺伝子発現研究を簡素化する自動化セルカウンターの使い方

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Optimized Transfection Strategy for Expression and Electrophysiological Recording of Recombinant Voltage-Gated Ion Channels in HEK-293T Cells

The in vitro expression and electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T) is a ubiquitous research strategy. HEK-293T cells must be plated onto glass coverslips at low enough density so that they are not in contact with each other in order to allow for electrophysiological recording without confounding effects due to contact with adjacent cells. Transfected channels must also express with high efficiency at the plasma membrane for whole-cell patch clamp recording of detectable currents above noise levels. Heterologous ion channels often require long incubation periods at 28&deg;C after transfection in order to achieve adequate membrane expression, but there are increasing losses of cell-coverslip adhesion and membrane stability at this temperature. To circumvent this problem, we developed an optimized strategy to transfect and plate HEK-293T cells. This method requires that cells be transfected at a relatively high confluency, and incubated at 28&deg;C for varying incubation periods post-transfection to allow for adequate ion channel protein expression. Transfected cells are then plated onto glass coverslips and incubated at 37&deg;C for several hours, which allows for rigid cell attachment to the coverslips and membrane restabilization. Cells can be recorded shortly after plating, or can be transferred to 28&deg;C for further incubation. We find that the initial incubation at 28&deg;C, after transfection but before plating, is key for the efficient expression of heterologous ion channels that normally do not express well at the plasma membrane. Positively transfected, cultured cells are identified by co-expressed eGFP or eGFP expressed from a bicistronic vector (e.g. pIRES2-EGFP) containing the recombinant ion channel cDNA just upstream of an internal ribosome entry site and an eGFP coding sequence. Whole-cell patch clamp recording requires specialized equipment, plus the crafting of polished recording electrodes and L-shaped ground electrodes from borosilicate glass. Drug delivery to study the pharmacology of ion channels can be achieved by directly micropipetting drugs into the recording dish, or by using microperfusion or gravity flow systems that produce uninterrupted streams of drug solution over recorded cells.

Reliable method for highly efficient in vitro expression and subsequent electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T).

発現とHEK - 293T細胞における組換え電位依存性イオンチャネルの電気生理学的記録用に最適化されたトランスフェクション戦略

The in vitro expression and electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T) ...

A Protocol for Phage Display and Affinity Selection Using Recombinant Protein Baits

Using recombinant phage as a scaffold to present various protein portions encoded by a directionally cloned cDNA library to immobilized bait molecules is an efficient means to discover interactions. The technique has largely been used to discover protein-protein interactions but the bait molecule to be challenged need not be restricted to proteins. The protocol presented here has been optimized to allow a modest number of baits to be screened in replicates to maximize the identification of independent clones presenting the same protein. This permits greater confidence that interacting proteins identified are legitimate interactors of the bait molecule. Monitoring the phage titer after each affinity selection round provides information on how the affinity selection is progressing as well as on the efficacy of negative controls. One means of titering the phage, and how and what to prepare in advance to allow this process to progress as efficiently as possible, is presented. Attributes of amplicons retrieved following isolation of independent plaque are highlighted that can be used to ascertain how well the affinity selection has progressed. Trouble shooting techniques to minimize false positives or to bypass persistently recovered phage are explained. Means of reducing viral contamination flare up are discussed.

Phage display is a powerful technique to capture proteins or protein moieties that interact with an immobilized molecule of interest. Once a decision of the type of phage cDNA library to create and screen has been made, the protocol described here permits efficient affinity selection leading to identification of interactors.

組換えタンパク質ベイトを用いてファージディスプレイおよび親和性選択のためのプロトコル

Using  recombinant phage as a scaffold to present various protein portions encoded by  a directionally cloned cDNA library to immobilized bait molecules ...

Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and the control of gene transcription in the cell nucleus. The kindlins are ~75 kDa multidomain proteins and bind to an NPxY motif and upstream T/S cluster of the integrin &#946;-subunit cytoplasmic tail. The hematopoietically-important kindlin isoform, kindlin-3, is critical for platelet aggregation during thrombus formation, leukocyte rolling in response to infection and inflammation and osteoclast podocyte formation in bone resorption. Kindlin-3&#39;s role in these processes has resulted in extensive cellular and physiological studies. However, there is a need for an efficient method of acquiring high quality milligram quantities of the protein for further studies. We have developed a protocol, here described, for the efficient expression and purification of recombinant murine kindlin-3 by use of a baculovirus-driven expression system in Sf9 cells yielding sufficient amounts of high purity full-length protein to allow its biophysical characterization. The same approach could be taken in the study of the other mammalian kindlin isoforms.

Kindlins are fundamental to cell adhesion through integrins but studies of them have been hampered by the difficulty encountered in expressing them recombinantly in bacterial hosts. We describe here methods for their efficient production in baculovirus-infected insect cells.

生物物理学研究のための昆虫細胞からの効率的な生産と組換えマウスKindlin-3の精製

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that regulates diverse biological pathways including the hypoxia response, proteostasis, the DNA damage response and transcription.&#160; To better understand how UBLs regulate pathways relevant to human disease, we have compiled a human siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; library consisting of 1,186 siRNA duplex pools targeting all known and predicted components of UBL system pathways. This library can be screened against a range of cell lines expressing reporters of diverse biological pathways to determine which UBL components act as positive or negative regulators of the pathway in question.&#160; Here, we describe a protocol utilizing this library to identify ubiquitome-regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia using a transcription-based luciferase reporter.&#160; An initial assay development stage is performed to establish suitable screening parameters of the cell line before performing the screen in three stages: primary, secondary and tertiary/deconvolution screening. &#160;The use of targeted over whole genome siRNA libraries is becoming increasingly popular as it offers the advantage of reporting only on members of the pathway with which the investigators are most interested.&#160; Despite inherent limitations of siRNA screening, in particular false-positives caused by siRNA off-target effects, the identification of genuine novel regulators of the pathways in question outweigh these shortcomings, which can be overcome by performing a series of carefully undertaken control experiments.

Here, we describe a methodology to perform a targeted siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; screen to identify novel ubiquitin and ubiquitin-like regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia.&#160; This can be adapted to any biological pathway where a robust read out of reporter activity is available.

培養哺乳動物細胞内の生物学的経路のユビキチンおよびユビキチン様システムレギュレータを識別するために、siRNAのスクリーニング

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

A Comparative Analysis of Recombinant Protein Expression in Different Biofactories: Bacteria, Insect Cells and Plant Systems

Plant-based systems are considered a valuable platform for the production of recombinant proteins as a result of their well-documented potential for the flexible, low-cost production of high-quality, bioactive products.
In this study, we compared the expression of a target human recombinant protein in traditional fermenter-based cell cultures (bacterial and insect) with plant-based expression systems, both transient and stable.
For each platform, we described the set-up, optimization and length of the production process, the final product quality and the yields and we evaluated provisional production costs, specific for the selected target recombinant protein.
Overall, our results indicate that bacteria are unsuitable for the production of the target protein due to its accumulation within insoluble inclusion bodies. On the other hand, plant-based systems are versatile platforms that allow the production of the selected protein at lower-costs than Baculovirus/insect cell system. In particular, stable transgenic lines displayed the highest-yield of the final product and transient expressing plants the fastest process development. However, not all recombinant proteins may benefit from plant-based systems but the best production platform should be determined empirically with a case-by-case approach, as described here.

In this study the expression of a target human recombinant protein in different production platforms was compared. We focused on traditional fermenter-based cultures and on plants, describing the set-up of each system and highlighting, on the basis of the reported results, the inherent limits and advantages for each platform.

細菌、昆虫細胞およびプラントシステムズ：異なるバイオファクトリーでの組換えタンパク質発現の比較分析

Plant-based systems are considered a valuable platform for the production of recombinant proteins as a result of their well-documented potential for the ...

High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension

The art of producing recombinant proteins with complex post-translational modifications represents a major challenge for studies of structure and function. The rapid establishment and high recovery from transiently-transfected mammalian cell lines addresses this barrier and is an effective means of expressing proteins that are naturally channeled through the ER and Golgi-mediated secretory pathway. Here is one protocol for protein expression using the human HEK293F and HEK293S cell lines transfected with a mammalian expression vector designed for high protein yields. The applicability of this system is demonstrated using three representative glycoproteins that expressed with yields between 95-120 mg of purified protein recovered per liter of culture. These proteins are the human Fc&#947;RIIIa and the rat &#945;2-6 sialyltransferase, ST6GalI, both expressed with an N-terminal GFP fusion, as well as the unmodified human immunoglobulin G1 Fc. This robust system utilizes a serum-free medium that is adaptable for expression of isotopically enriched proteins and carbohydrates for structural studies using mass spectrometry and nuclear magnetic resonance spectroscopy. Furthermore, the composition of the N-glycan can be tuned by adding a small molecule to prevent certain glycan modifications in a manner that does not reduce yield.

Laboratory-scale production of eukaryotic proteins with appropriate post-translational modification represents a significant barrier. Here is a robust protocol with rapid establishment and turnaround for protein expression using a mammalian expression system. This system supports selective amino acid, selective labeling of proteins and small molecule modulators of glycan composition.

懸濁液中のHEK293細胞の一過性トランスフェクションによる組換えヒトタンパ​​ク質のハイ・イールド式

The art of producing recombinant proteins with complex post-translational modifications represents a major challenge for studies of structure and ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex signaling mechanisms underlying filopodial initiation, elongation and subsequent stabilization or retraction, it is crucial to determine the spatio-temporal protein activity in these dynamic structures. To analyze protein function in filopodia, we recently developed a semi-automated tracking algorithm that adapts to filopodial shape-changes, thus allowing parallel analysis of protrusion dynamics and relative protein concentration along the whole filopodial length. Here, we present a detailed step-by-step protocol for optimized cell handling, image acquisition and software analysis. We further provide instructions for the use of optional features during image analysis and data representation, as well as troubleshooting guidelines for all critical steps along the way. Finally, we also include a comparison of the described image analysis software with other programs available for filopodia quantification. Together, the presented protocol provides a framework for accurate analysis of protein dynamics in filopodial protrusions using image analysis software.

We present a software solution for semi-automated tracking of relative protein concentration along the length of dynamic cellular protrusions.

動的細胞突起におけるソフトウェア支援トラッキングのためのグラフィカルユーザインタフェース

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...