この方法は、環境や人間の健康に対する毒性の影響が懸念され、ほとんどの殺虫剤が段階的に廃止されている現状を踏まえ、商業農業生態系における重要な害虫を防除するために、昆虫病原性真菌の感染性分生子を大量生産する方法に関する新しい情報を提供します。この技術は、大量生産中にEPF分生子の最適な収率を保証するために使用される方法を説明しています。この方法は、農業生態系における有害な殺虫剤耐性昆虫害虫の大規模管理に対する大量生産分生子の有効性に関する洞察を提供することにより、統合された害虫管理および生物学的防除に役立つ。
この手順は、Letodi Luki Mathulwe博士、Nomakholwa Faith Stokwe博士、Antoinette Paula Malan教授によって開発され、実証されました。1リットルの蒸留水を加熱し、沸点に達する前に火を止めます。次に、30グラムのグルコース、4グラムのリン酸カリウム二塩基、20グラムの酵母エキス、15ミリリットルのコーンスティープリカーを加え、内容物を2〜3分間穏やかに沸騰させます。
合計100ミリリットルの培地を9つの異なる250ミリリットルフラスコに注ぐ。各フラスコにコットンウールプラグを置き、栓としてアルミホイルでコットンウールを覆います。フラスコ内の培地を121°Cで55分間オートクレーブする。
その後、フラスコ内の培地を冷却し、各フラスコ内の培地にストレプトマイシン1ミリリットル当たり10ミリグラムを加える。両方のEPF分離株について、2〜3週齢の真菌培養プレートから真菌分生子の2〜3個の細菌ループを収集する。真菌分生子を滅菌条件下で250ミリリットルフラスコ内の液体培地の各100ミリリットルに移し、フラスコを密封する。
液体培養フラスコを約25°Cで140RPMのオービタルシェーカー上で3日間インキュベートし、培養物が真菌芽胞子の成長を伴う高い濁度の徴候を示したらインキュベーションを停止する。培養物からの細菌汚染の可能性を検出するために、24時間の培養後に各液体培養フラスコから100マイクロリットルのサンプルを引き出し、単離物ごとに3つのSDAプレート上にプレートする。プレートをプラスまたはマイナス25°Cの制御された温度で48時間インキュベートする。
小さなポリ塩化ビニル廃液パイプを使用して、オートクレーブバッグの開放端に発酵バッグ用のネックを作成し、オートクレーブテープを使用してパイプを固定します。発酵中に十分なガス交換を可能にするために、滅菌コットンウールプラグでパイプを閉じます。パーボイルド長粒白米を、メタリシウム・ピンヘンセとメタリシウム・ロバーツイの両方の芽胞子の固体基質培地として使用する。
発酵袋ごとに、1キログラムの米と300ミリリットルの滅菌蒸留水を加える。発酵袋の内容物を静かに混ぜる。それらを外側のオートクレーブバッグに入れ直立させ、121°Cでオートクレーブを55分間置きます。
オートクレーブ処理に続いて、基板を滅菌条件下で約45分間冷却します。メタリシウム・ピンヘーンセおよびメタリシウム・ロベルツィイの両方のそれぞれの液体培養フラスコの閉鎖を層流下で取り出し、各フラスコの縁を10秒間炎上させた。コットンウールのプラグを首から取り外して、発酵バッグに100ミリリットルの液体培養物を注ぎます。
綿のプラグを元に戻し、バッグの首の上部を輪ゴムで固定された手術用紙で覆います。袋の上部をひねり、マッサージで基材を振ったり操作したりして、袋の中身を混ぜます。袋内の基質を平らにして、厚い床の形成を防ぐために、袋を約25°Cでインキュベートする。
接種・インキュベーションの2~3日後、真菌による基質の結合と目に見える菌糸増殖が生じていた場合には、袋内容物をマッサージして発酵袋内の基質を壊す。発酵後、胞子状培養物を26〜30キログラムの茶色の紙袋に移し、真菌培養物を試験で使用する前に10〜12日間乾燥させる。紙袋の引張強度を向上させるために、袋の上部の1/3を水平に切断し、袋の底部を並べる。
各発酵バッグ内の基質を穏やかに崩壊させる。各袋の角を切り取り、切り取られた角が残したスペースを通して文化全体を紙袋にゆっくりと移します。各紙袋にラベルを付け、各袋の上端を2回折り、ホチキス止めで閉じて三角形のテント構造を作成します。
バッグをワイヤー乾燥ラックに置き、約25°Cの制御された温度と30〜40%の低湿度で適切に乾燥できるように、収集鍋に取り付けられた3つの入れ子になったふるいを使用して、培養物から真菌分生子を収穫します。乾式培養サンプルをETSメッシュ番号35およびふるいにゆっくりとロードする。真菌の分生子が空気中に放出されるのを防ぐためにふるいにかける。
10〜12個のガラス大理石をふるいに追加して、メッシュスクリーンを通る真菌分生子の通過を支援し、篩内の分生子の保持を回避し、胞子の回収を減少させる可能性がある。電気テープを使用してふるいの目地をテープで固定し、密封する。粘着性パッドを取り付けた振動シェーカーの上にふるいを置き、毎分560〜640振動の動きで収集パンとふるいを20〜25分間固定する。
採取パンから試験ふるいを取り出し、分生子を採取し、採取した分生子を気密で水不透過性のジッパーロック袋に保管し、長期保存する。平均約1.83グラムの乾燥したメタリシウム・ロベルツィイ・コナディアがフレーク状の大麦基質から収穫されたが、基質からはゼロのメタリシウム・ピンヘンセが収穫された。いずれのメタリジウム種についても、フレーク状のオート麦基質から乾燥真菌分生子は採取されなかった。
メトリシウムの2つの種の間には、米粒から収穫されたグラムあたりの推定平均分生子において有意差が観察された。メタリシウム・ロベルツィイは、メタリシウム・ピンヘーンセよりもグラム当たりの平均分生子数がわずかに高かった。使用済みイネ基質上に存在する分生子の推定数において、メタリシウムの2種間に有意差は認められなかった。
しかしながら、メタリシウム・ピンヘンセは、メネ基質上にわずかに高い分生子を有していたが、メタリシウム・ロベルツィイよりも、イネ基質培養物から得られたそれらの全体的な分生子収量においてメタリシウムの2種において有意差は推定されない。しかし、メタリシウム・ピンヘーンセは、より低い分生子収量を生み出したメタリシウム・ロバーツイよりもわずかに高い分生子収量を生み出した。この技術の困難な部分は、汚染された芽球胞子接種剤による接種による基質汚染である。
したがって、作業中は常に無菌性を確保してください。このデモンストレーションは、学生がプロセス全体の終了につながる可能性のある不器用な間違いなしにテクニックを効率的に再現するのに役立ちます。
