この方法論は、コヒーレントラマンイメージングを使用して局所適用された薬物製品を定量するための再現性のある正確な方法を可能にするという点で重要です。他の方法論は、かさばる皮膚薬物動態情報を提供し、一方、この方法論は、薬物の透過経路などのバルクおよびマイクロスケールの皮膚薬物動態情報の両方を提供することができる。可視化・定量化・浸透経路により、特定の経路を念頭に置いた医薬品の開発が目的部位に到達することが可能になります。
組織調製は、この方法論の最も困難な部分であることが証明されます。組織は、皮膚を通して読むことができるように十分に薄くなければならない。ヌードマウスの耳皮膚組織の調製を開始するには、安楽死させたヌードマウスを取得し、鉗子および顕微手術ハサミを使用してマウスの耳を除去する。
次に、60ミリメートル×15ミリメートルの大きさの大きなペトリ皿に片方の耳を置きます。次に、マウスの耳をPBSで2回すすぎ、毎回タスクワイパーで耳を乾かします。24時間以内に使用する場合は、PBSの耳を2〜8°Cの35ミリメートル×10ミリメートルの小さなペトリ皿に入れます。
収穫の24時間後に使用するには、PBSのないペトリ皿に耳を入れ、パラフィルムで皿を覆ってマイナス20°Cの冷凍庫に保管します。生物学的フードの下で作業している間、皮下脂肪がアクセスできるように、角質層側が下を向いた大きなペトリ皿に人間の皮膚組織を置きます。その後、鉗子と顕微手術はさみを使用して皮下脂肪を除去します。
皮下脂肪がハサミで除去できなくなったら、10枚の刃の使い捨てメスを皮膚に対して45度の角度で使用し、鉗子で皮膚を静止させながら残りの皮下脂肪を除去します。脂肪が取り除かれたら、人間の皮膚を1センチ×1センチに切断する。脂質イメージングのために、マウス耳の前部を35ミリメートルの番号ゼロの皿のガラス底に向かって向けて配置する。
ヒトの皮膚の場合、角質層を伏せて皮膚を配置し、表面層から深層への薬物定量を可能にする。組織がガラス底に集中したら、綿の先端アプリケーターを使用して、皮膚が平らで、ガラス底皿のカバースリップ面と完全に接触していることを確認します。イメージング中の動きを防ぐには、ワッシャーを皮膚の上に置き、刺激ラマン散乱またはSRS透過検出のためにワッシャーの中央穴から組織が見えるようにします。
予め決定された用量の製剤を皮膚上にピペットし、次いで手袋をはめた指を用いて製剤を時計回りに30秒間擦る。製剤が透過するまでに割り当てられた時間が経過した後、製剤側がガラス底皿に向かって向くように皮膚を配置する前に、余分な製剤を除去する。次に、顕微鏡制御またはMCソフトウェアをオンにして実験セットアップに進みます。
接眼レンズを通して、調整ノブで軸方向の焦点を調整して、組織の焦点が合っていることを確認します。完了したら、ポンプビームとストークスビームの両方のブロックを解除し、ALG1 および ALG2 チャネルが有効になっていることを確認します。SRSフォトダイオードがコンデンサーの上にあることを確認し、MCソフトウェアの[フォーカスx2]をクリックして、CARSおよびSRSチャンネルのスキンを視覚化します。
マルチエリアタイムラプスまたはMATLモジュールで、[表示]タブに移動し、[登録済みポイントリスト]をクリックしてイメージングリストを表示します。角質層が特定されたら、軸方向の焦点またはZ焦点をスクロールして、特定の組織層別化を同定する。特定の深さは、角質層、皮脂腺、脂肪細胞、または皮下脂肪などの皮膚内に、脂質同調コントラストを有するライブイメージング中に決定されるように、追加することができる。
ただし、深度スタック全体を取得する場合は、XY 位置を追加でき、相対的な Z 位置は無視できます。各スキン層別化に固有の深度をイメージングする場合は、レジスタポイントを選択してMATLキューに追加します。完全な深さスタックの場合は、「集録パラメータ」ウィンドウで「深さ選択機能を持つ各 XY 位置の登録点」をクリックします。
次に、MATLモジュールで繰り返し回数を1に設定し、[準備完了]をクリックします。Play 矢印がグレーから黒に変わったら、Play を押して予備脂質スタックのイメージングを開始します。イメージングサイクルが完了したら、ポンプビームとストークスビームの両方をブロックし、レーザーグラフィカルユーザーインターフェイスの波長を、ターゲット波数またはラマン振動に基づいて目的の波長に変更します。
手動の時間遅延ステージを調整しながら、先験的に確立された脂質および医薬品有効成分またはAPIを画像化するために同じ電力が使用されるようにします。サイクルの繰り返しの合計数を選択したら、ポンプビームのブロックを解除し、フォトダイオードを使用して電力が目的の電力と一致するかどうかを確認する前に、再生を押してセットポイントの自動イメージングを開始します。次に、皮脂腺脂質画像をフィジーにインポートし、[チャネルの分割]というラベルの付いたボックスにチェックを入れて、ファイルをCARSチャネルとSRSチャネルに分割することで、各皮膚層別化のデータ分析を実行します。
関心領域またはROIマネージャを開くには、[分析]、[ツール]、[ROIマネージャ]をクリックします。C が 1 に等しくなるように SRS チャネルを使用して、画像内の皮脂腺をデマーキーし、ROI マネージャーの [T の追加] をクリックしてマーキングを ROI マネージャーに追加します。画像内の各皮脂腺についてこのプロセスを繰り返します。
脂質が豊富な領域をマスクするには、各ROIを選択し、[その他]、[または結合]、[追加]タブの順にクリックします。脂質不足の領域をマスクするには、フィジーメニューの長方形ツールを使用して、画像全体の周りに正方形を描画します。ROI マネージャーに地域を追加します。
ROIマネージャですべての脂質リッチ領域を選択するROIに加えて、新しく追加された正方形ROIをクリックします。[その他] で [XOR] を選択して脂質不良領域のマスクを生成し、ROI マネージャーに追加します。画像、スタック、ツール、および連結タブの順に移動して、画像を番号順に連結します。
または、画像をフィジーにロードし、セットアップページで同様の名前のファイルをグループ化するというオプションを選択して、画像をインポートします。連結された画像をアクティブにしたまま、ROI マネージャに移動して脂質が豊富な領域を選択し、[その他] タブをクリックしてから [マルチメジャー] を選択し、[結果] ウィンドウが表示されるのを待ちます。「結果」ウィンドウから、データをスプレッドシートにエクスポートし、「領域」というタイトルの列を追加して、脂質が豊富な領域をデータの各行に追加します。
脂質の外側にあった領域に脂質不良を加える。データを視覚化するには、スプレッドシートを保存してRパッケージggplot2にインポートします。次に、画像を画像数対平均強度の関数としてプロットし、濃度-時間データを推定します。
スプレッドシートからインポートされた強度時間データに対して、RStudio で非コンパートメント解析または NCA を 1 つのレイヤーの呼び出しで実行します。完了したら、Jmax メトリックと AUCflux すべてのメトリックをプロットして視覚的に比較します。さらに、実験条件間で統計的比較を行う。
代表的な分析は、角質層、皮脂腺、脂肪細胞、ヌードマウス耳皮膚からの皮下脂肪、および角質層、真皮乳頭、およびヒト皮膚からの皮脂腺を描写する。ヌードマウス耳皮膚において、皮脂腺の限られた組織移動は、製剤適用時および適用後120分で腺の同じ組織深さで観察された。皮膚における実質的な組織運動は、薬物適用の120分後にかろうじて見える皮脂腺を示し、元のプロトコルの非効率性を実証した。
いくつかの研究では、強度対時間プロファイルは高い初期濃度を示し、続いて濃度が低下し、組織への薬物のさらなる吸収がないことを示した。一方、いくつかの研究は、後に実験期間にわたって減少した強度の上昇を示し、組織へのフラックスが画像化前に最大に達していなかったことを実証した。同じAPIに対する2つの製剤の濃度時間プロファイルのNCA分析は、エトキシエトキシエタノールが、皮膚層に関係なくゲル製剤のそれと比較して拡張されたAPI透過を提供することを示した。
同じ製剤間の全暴露分析では、皮膚のより深い層で同様の観察結果が示された。薬物塗布後のヒト皮膚の調製およびガラス底皿への適切な皮膚配置は、実験の成功にとって極めて重要である。ここでの明確な解決策は、この方法論の適合性を実証しました。
さらなる研究には、製剤がAPIの浸透と浸透にどのように影響するかを理解するために、クリームなどの市販の製剤が含まれます。
