Gunzer研究所の研究は、ドイツ連邦教育研究省（付与番号0315590 AD）およびドイツ研究財団（付与番号GU769 / 4-1、GU769 / 4-2）の支援を受けていた。テクニカルサポートについてはIMCES、3D漫画モデリングについてはSebastian Kubatに感謝いたします。

すべての動物実験はEUのガイドラインに従って実施され、エッセン（AZ 84-02.04.2014.A036 - LandesamtfürNatur、Umwelt und Verbraucherschutz Nordrhein-Westfalen、Essen、Germany）の関連する地方当局によって承認された。動物を使用し、特定の病原体不含（SPF）条件下で飼育した。 ジフテリア毒素（DTX）による心筋炎の誘導<ol><li>リン酸緩衝生理食塩水（PBS）でDTXストック溶液を希釈して1μg/ mLの作業溶液にすることにより、心筋炎の誘導のためのDTX溶液を調製する。 </li><li> Hasenberg らが示すように、この溶液100μLを8-10週齢のCD11c.DTRマウス（ 約 5 ng / g体重（bw））に気管内投与する。真菌の胞子懸濁液の適用20 。 注：毒素の腹腔内適用は、致命的な心筋炎。しかし、このアプローチはまず検証されなければならない。 <ol><li>それを適用するために、ケタミン100mg / kgおよびキシラジン10mg / kgの腹腔内（腹腔内）注射によって動物を麻酔する。 </li><li>深刻な麻酔（トウピンチ試験）に達した後、22Gの留置静脈カテーテルを口腔に通して動物に挿管する。 Hasenbergらによって示されているように、動物を小型動物呼吸器で毎分250回、息当たり250μLの吸入量で換気することにより、レンズチューブの正しい位置を確認する。 al。 20 。 注記：正しく配置すると、適用された換気設定に従って動物の呼吸数が変化します。 </li><li>換気システムを外し、100μLのDTX溶液または対照と同じ量のPBSをカテーテルを通して肺に注入し、動物をさらに1分間換気し続ける。 </li></ol></li><li>動物を麻酔から回復させ、一般的な健康状態および体重変化を4日間監視する。 注：遺伝的背景、マウスのひずみ、または最初の体重に応じて、心筋炎の重篤度および発症率が異なり、最初に決定する必要があります。 </li></ol> 2.薄いシート顕微鏡の試料調製<ol><li>毒素適用の4日後に、気化した2％イソフルラン/酸素混合物で誘導チャンバーをフラッシュすることによってマウスを麻酔する。レトロ軌道の適用経路を使用して50μLのPBS中に15μgの直接標識抗CD45抗体（クローン30-F11、AlexaFluor647（AF647））を静脈内（iv）注入し、非常に迅速かつ高精度の抗体の正しい量。 注：マウスがリカンベントであり、つまんでピンチテストに反応しない場合、所望の麻酔深度に達している。 </li><li> 2時間のインキュベーションの後、マウスを頸部脱臼により屠殺し、5mLのPBS / EDTA（5mM） をその場で灌流する。 <ol><li>心臓を露出させ、21Gカテーテルを用いて右心室に灌流溶液を注入する。ゆっくりと一定の圧力で灌流し、大動脈を切開した後に血液を抜くことができることを確認する。 注：この心筋灌流は、器官の最終的な3D視覚化を妨げる可能性がある、わずかな準備アーチファクトをもたらすことがある。したがって、高度な動物実験者は、下大静脈を通して腹部大動脈を切除し、腹部大動脈を切除することができた。 </li></ol></li><li> 化学的固定のために、5mLの4％パラホルムアルデヒド（PFA）を用いて同じくぼみを通して心臓を灌流する。カテーテルを所定の位置に保持し、PFAで満たされた新しいシリンジを単に取り付ける。ゆっくりと一定の圧力で熟す。 注：パラホルムアルデヒドは非常に毒性が強い。皮膚、眼、および他の粘膜との接触を避ける。 <ol><li>穏やかに鋸歯状鉗子で心臓をつかむ。 puそれはやや上向きです。出入りする動脈および静脈を含むすべての組織接続を切断する。さらなる固定のために、器官を4％PFAでさらに4時間保管する。 </li></ol></li><li>臓器を脱水するには、暗所で4℃、50％、70％、100％でそれぞれ12時間、上昇するエタノールシリーズで心臓をインキュベートする。ここでは、黒い5 mLのポリプロピレン製反応管を使用し、気泡の発生を防ぐためにゆっくりとした回転速度を使用して管回転装置で絶えず回転させます。 </li><li>化学薬品による完全なサンプル調製。心臓を透明にするために、常に一晩中回転させながら、それらを98％ジベンジルエーテル（DBE）中でインキュベートする。 注：DBEは眼、皮膚、および呼吸器系を刺激する。 </li></ol>光シート顕微鏡<ol><li>ライトシート顕微鏡を使用してLSFMを実施します（材料表を参照）。顕微鏡の標準試料ホルダー上の試料をDBE充填Cu30mm×30mm×15mmまでの標本に適したベットである。 </li><li> 脱水され、クリアされたアガロースブロックを使用して、画像取得の間、試料を適所にしっかりと保持する。 <ol><li>アガロースブロックを調製するために、2％溶融アガロースを金型（15mm×15mm×5mm）に注ぐ。凝固するまでアガロースを冷ます。 </li><li>上向きエタノールシリーズ（50％、70％、100％で2回）で脱水する。アガロースブロックを98％DBEで一晩インキュベートする。アガロースを使用するまでDBEに保存する。 注：アガロースは主に水で構成されているため、各脱水段階のインキュベーション時間は、ブロックのサイズに応じて延長される場合があります。 注：DBEは眼、皮膚、および呼吸器系に刺激を与えます。 </li><li>必要に応じて、準備されたアガロースブロックを鋭利なメスを使用して所望の形状に切断する。典型的には、プリズムまたはくさび形の形状を切断して、サンプルアダプターの端に配置します。 注：アガロースブロックは弾性であるため、わずかな力で押されたときにサンプルは定位置にとどまります。 </li></ol></li><li> 適切な励起および発光フィルター設定で目的の蛍光シグナル（ここでは、自己蛍光および抗CD45抗体染色）を検出する。 <ol><li>結合組織由来の自己蛍光シグナルを検出するには、励起波長488 nm（OPSL：50 mW）で525/50 nmのバンドパスフィルターを使用します。 AF647結合抗体によるCD45染色は、668nm（バンドパスフィルター：680 / 30nm）および647nmの励起波長（ダイオードレーザー：50mW）で検出される。 </li><li> 2つの個別のz平面間の距離として4μmを選択します。 </li></ol></li></ol> 4.画像後処理注：得られたデジタル画像データは、科学的3D / 4D画像処理および分析ソフトウェア（材料の表を参照）でさらに処理した。 <ol><li> データファイルのオープンと事前調整。 </stロング&gt; <ol><li>分析ソフトウェアを起動した後、左上隅の &quot;Surpass&quot;ボタンを選択します。画像スタックを開くには、「ファイル」、「開く」を選択し、最初に取得したチャンネルのデータを含むフォルダを選択します。追加のチャンネルを追加するには、[編集]と[チャンネルを追加]を選択します。 注記：データサイズやコンピュータシステムによっては、この処理に数分かかることがあります。提示されたプロトコールは、2つの獲得チャネル（自己蛍光およびAF647）の全てのステップを示す。 </li><li> 「編集」をクリックして「画像のプロパティ」を選択して、x、y、zボクセルの寸法を修正します。新しいウィンドウが開いたら、パラメータを調整します。 注：このステップは、使用される顕微鏡システムおよび特定のデータフォーマットに依存します。正しいxyz値は、後続のサイズおよび遠隔測定には重要です。ほとんどの場合、これらのパラメータは、顕微鏡写真ファイルにメタデータとして保存されます。ただし、ファイルformatは分析ソフトウェアによって正しく解釈されないため、手動でピクセルサイズを入力することが重要です。 xおよびy次元のピクセルサイズは、カメラのピクセルサイズ、適用される可能性のあるビニング、およびレンズと対物レンズの倍率によって異なります。 zのピクセルサイズは、自己定義されたzステップサイズ（ 例えば、 4μm）に等しい。 </li></ol></li><li> チャンネルの調整 <ol><li>まず、 &quot;Display adjustment&quot;（ &quot;Edit&quot;と &quot;Show Display Adjustment&quot;）を開いて、自家蛍光信号をグレースケールに変換します。新しいウィンドウには、開いているすべてのチャンネルとそのすべての表示設定が表示されます。デフォルトの色を変更するには、自己蛍光チャンネルを選択し、 &quot;白&quot;表示スタイルを選択します。 「OK」をクリックして適用します。 </li><li>黒レベル調整の場合は、「表示調整」に戻って黒レベルの値を調整して、サンプル構造を表さない不要なバックグラウンド信号を除外しますs。 <ol><li>これを行うには、チャンネルバーの左上三角形を左から右にドラッグします。 注：変更はすぐに視覚化されます。サンプルから派生していない信号のみを抑制するようにしてください。ノイズ信号が追加の計算に必要となる可能性があるため、ピッチ黒画素を避けるために、バックグラウンドの最小値を決して &quot;0&quot;にしないでください。画像取得後にすべての黒レベルの変更が実行されていることを確認してください。そうしないと、貴重なサンプル情報が失われる可能性があります。黒レベルの調整は代表的な目的にすぎません。異なるサンプルで同じディスプレイ設定を使用するには、チャンネルリストの下の「最小」の数値フィールドに正確な値を入力します。これは定量分析に非常に役立ちます。 </li></ol></li><li>右上の三角形を使用してそれぞれのチャンネルの強さを調整するか、またはチャンネルの下の「最大」数値フィールドに正確な値を入力することによって、強度調整を実行しますリスト。 </li><li>チャンネルバーの中央にある下三角をドラッグしてガンマ値を増減するか、または正確な値を入力して、コントラスト調整を実行します。 </li><li>自己蛍光チャンネルに従ってAF647チャンネルを調整します。違いとして、AF647信号の可視化をヒートマップカラールックアップテーブルに設定します。手順4.2.1と同様の方法でチャンネルモード「火」を選択してください。 注：全体のシグナル強度は自己蛍光チャネルに比べて大幅に低いので、黒レベルは通常より低い値に調整されます。自己蛍光チャネルに関しては、このチャネルの輝度は通常増加する。 </li><li> 「ブレンドモード」を選択して、組織構造を詳細に視覚化します。 1つのシリーズのすべてのサンプルを同じパラメータ値で分析します。 </li></ol></li><li> 仮想クリッピング <ol><li> 3Dシーンのエキスポの前にオルガンを事実上切り開くにはレンダリングされた3Dオブジェクトにクリッピングプレーンを適用します。 <ol><li>オブジェクトリストの &quot;Clipping Plane&quot;アイコン（はさみ）をクリックします。画像ビュー内で、黄色の枠とマニピュレータ（白いスピンドル）が表示されます。スピンドルを薄い方の端でマウスで回転させると、クリッピング面の向きが変わり、スピンドルの中央部が厚くなり、必要なクリッピングの深さが選択されます。 </li><li>オブジェクトリストの下のそれぞれのチェックボックスをオフにして、フレームとマニピュレータを非表示にし、目的のスナップショットを作成します。 </li></ol></li></ol></li></ol>

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Protoc. 9 (7), 1682-1697 (2014).</li><li>Schwarz, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent-protein+stabilization+and+high-resolution+imaging+of+cleared,+intact+mouse+brains.">Fluorescent-protein stabilization and high-resolution imaging of cleared, intact mouse brains.</a> PLoS One. 10 (5), e0124650 (2015).</li><li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scale:+a+chemical+approach+for+fluorescence+imaging+and+reconstruction+of+transparent+mouse+brain.">Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain.</a> Nat. Neurosci. 14 (11), 1481-1488 (2011).</li><li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-brain+imaging+with+single-cell+resolution+using+chemical+cocktails+and+computational+analysis.">Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis.</a> Cell. 157 (3), 726-739 (2014).</li><li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+phenotyping+within+transparent+intact+tissue+through+whole-body+clearing.">Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing.</a> Cell. 158 (4), 945-958 (2014).</li><li>Shivapathasundharam, B., Berti, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transparent+tooth+model+system.+An+aid+in+the+study+of+root+canal+anatomy.">Transparent tooth model system. An aid in the study of root canal anatomy.</a> Indian J. Dent. Res. 11 (3), 89-94 (2000).</li><li>Karreman, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+and+precise+targeting+of+single+tumor+cells+in+vivo+by+multimodal+correlative+microscopy.">Fast and precise targeting of single tumor cells in vivo by multimodal correlative microscopy.</a> J. Cell Sci. 129 (2), 444-456 (2016).</li><li>Pan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shrinkage-mediated+imaging+of+entire+organs+and+organisms+using+uDISCO.">Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO.</a> Nat. Methods. 13 (10), 859-867 (2016).</li></ol>

著者は何も開示することはない。

現代の生命科学では、生物学的プロセスの顕微鏡視覚化がますます重要な役割を果たしている。この文脈では、この時点までに対処できない質問に答えるために役立つ過去2世紀の間に多くの開発が達成されました。第1に、光学顕微鏡の解像度能力を根本的に増加させる明らかな傾向があった。一度仮定された分解能制限による構造化照明顕微鏡（SIM） 21,22 、誘導?...

光学顕微鏡の進化の間、多くの特殊な形態が現れ、それらの全てが特定の標本の視覚化プロセスの限界を最小限に抑えるために開発された。このような方法の1つは、薄シート蛍光顕微鏡法（LSFM）である。最初にSiedentopfとZsigmondy 1によって1903年に開発され、1990年代初頭の最初の基本的な生物学的応用を発見した2。LSFMは、蛍光シグナルの分解能を持つ無傷のマウス器官などの大きな標本の視覚化のための最も強力な顕微鏡ツール細胞レベルまで低下する。これらの利点のために、生存細胞イメージングの可能性と組み合わせて、Nature MethodsはLSFMを「2014年の方法」 3と名付けました。 名前が示唆するように、LSFMでのサンプル照明は、使用される対物レンズの軸に垂直に向けられた光シートによって行われますまたは発光光収集およびその後の画像形成を含む。光シートは、通常、シリンドリカルレンズを用いて広いコリメートされたレーザビームを集束することによって、またはただ1つの水平または垂直平面4,5 において狭く集束されたレーザビームの迅速な横方向移動によって生成される。このようにして、結像光学系の焦点面のみが、典型的には1~4μmの厚さで照明される。その結果、照明面に置かれた蛍光試料については、散乱光の生成と、焦点面の上方または下方の領域からの光退色の影響がともに排除または大幅に抑制される6,7 。すべての焦点外れ面が照らされないので、これらの領域では光退色効果は省略される。標準的な共焦点または多光子顕微鏡法とは対照的に、照射された光および放出された光の経路は互いに分離されているので、最終的な画像品質<html>対物レンズを通る励起光ビームの完全な集束には依存しない。基礎となる質問に依存して、膨大な視界（FOV）を有する対物レンズを使用することが可能であり、照明された平面の可能な限り大きな領域を、xy方向に移動する構成部品なしで撮像することができる。 現代のLSFMシステムでは、生成された光学セクションの蛍光画像が、高感度の電荷結合素子（CCD）または相補型金属酸化膜半導体（CMOS）カメラ上に捕捉され、視野全体（FOV）マイクロ秒単位。したがって、光シートを通って試料を移動させ、規定されたzステップで画像を取得することによって、合理的な時間8,9 において試料の完全な3D情報を得ることができ、この技術を生細胞に適用することができる研究10 、ass = &quot;xref&quot;&gt; 11,12。 それにもかかわらず、LSFMは迅速で、感度が高く、蛍光に優しい方法を提供するが、特に大きな生体試料が3D解析の標的である場合、標本を通る光の伝達は依然として大きな問題である。光の透過率は、吸収の物理的な側面と屈折率の異なる構造の界面での光の散乱によって決定的に変化します13 。したがって、数ミリメートルの大きさの試料を撮像する場合、LSFMは、大部分が透明化プロトコルと組み合わされて、試料を光学的に透明にする。これらの技術は、それぞれの生物学的組織から水分を除去し、特定の標的組織成分の屈折率に狭く一致するように選択された水または（有機）溶媒ベースの液浸媒体と交換するという考えに基づいている。その結果、横方向散乱が最小限に抑えられ、すべての波長より効率的に組織13を通過することができる。多くの場合、このように処理された生物学的標本はマクロ的に結晶透明であり、長い作動距離、低倍率の目的を用いてLSFMをマウスの器官全体でさえも導くことができる。 ここでは、心筋炎マウスモデルの細胞心臓浸潤を調べるために確立した薄いシート顕微鏡（材料の表を参照）での大量サンプルイメージングの準備プロトコールを示します。 CD11c.DTRマウスは、CD11cプロモーター16の制御下で霊長類ジフテリア毒素受容体（DTR）を発現する。その結果、DTRとともにCD11cを発現するこれらのマウスの細胞は、 Corynebacterium diphtheria （ジフテリア毒素、DTX）の外毒素に対して感受性になる 。これらの動物をDTXで全身治療すると、すべてのCD11c + ceが枯渇するlls。 CD11cはインテグリンであり、様々な異なる可溶性因子の細胞表面受容体として、主に単球系譜17の細胞において活性化および成熟プロセスに関与する。その結果、CD11c.DTRマウスモデルは、多くの異なる免疫学的質問の文脈における樹状細胞およびマクロファージサブセットの役割を研究するために集中的に使用されている。時間の経過とともに、DTXで全身治療されたCD11c.DTRマウスは有害な副作用を引き起こし、死亡率が著しく上昇することが報告されている18,19。最近、本発明者らは、これらの動物における気管内DTX適用後の劇症性心筋炎の発症を説明する、根本的な死因15を特定することができた。毒素攻撃は、心臓における刺激伝達系の中心部を含む細胞破壊を引き起こした。これには大量のCD45+白血球浸潤、最終的に致命的な心臓不整脈に至る。この場合、白血球集団の出現が重要であるだけでなく、心臓内部の空間分布も重要であった。この実験的問題は、現代の顕微鏡イメージングの課題であり、私たちは、生体内抗体染色および有機溶媒ベースの光学的クリアリングプロトコルによって支持される薄いシート顕微鏡法によって解決した。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>diphtheria toxin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D0564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphate buffered saline</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>L182-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ketamine [50 mg/ml]</td>
			<td>Inresa</td>
			<td>PZN 4089014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xylazine [2 %]</td>
			<td>Ceva</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe</td>
			<td>Braun</td>
			<td>REF 9161502</td>
			<td>Braun Omincan F&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>indwelt venous catheter&#160;</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>REF 381923</td>
			<td>BD Insyte Autoguard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>small animal respirator</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>73-0044</td>
			<td>MiniVent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anit-CD45 antibody (AF647)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>103124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) disodium salt dihydrate</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>8043.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>catheter (21 G)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>REF 387455</td>
			<td>BD valu-set</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE tube (5 ml)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>EKY9.1</td>
			<td>Rotilabo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethanol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9065.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dibenzyl ether</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>108014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tube rotator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-753</td>
			<td>MACSmix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>agarose (low gelling)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A4018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mold (15x15x5 mm)</td>
			<td>Tissue Tek</td>
			<td>4566</td>
			<td>Cryomold&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>light sheet microscope system</td>
			<td>LaVision Biotec</td>
			<td></td>
			<td>Ultramicroscope&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microscope body</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>MVX10&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>0.5&#160;NA MVPLAPO 2XC, WD 5.5&#160;mm&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sCMOS camera 5.5MP</td>
			<td>Andor Technology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>488 nm OPSL (50mW) laser</td>
			<td>Coherent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>647 nm&#160; diode laser (50mW)</td>
			<td>Coherent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D image processing &#38; analysis software</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td></td>
			<td>IMARIS Ver. 8.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>transgenic mouse strain</td>
			<td>Steffen Jung et al.</td>
			<td></td>
			<td>CD11c.DTR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>wt mouse strain</td>
			<td>Envigo</td>
			<td></td>
			<td>Balb/c Ola Hsd J</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Module</td>
			<td>LaVision Biotec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MVPLAPO 2XC Objective Lens</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative visualization of leukocyte infiltrate in a murine model of fulminant myocarditis by light sheet microscopy

Light-sheet fluorescence microscopy（LSFM）は、化学的クリアリングプロトコールと組み合わせて、大きな生物学的試料中の蛍光標識された構造を分析するためのゴールドスタンダードとなっており、細胞分解能に達しています。その一方で、基礎となるプロトコルの絶え間ない改良と特殊な商用システムの利用性の向上により、マウスの器官全体の微細構造を調べることができ、様々な生存細胞イメージングアプローチにおける細胞の挙動の特徴づけまで可能にしました。ここでは、炎症を起こしたマウスの心臓におけるCD45 +白血球集団の空間的全マウント視覚化および定量化のためのプロトコルを説明する。この方法は、致命的な心臓不整脈を特徴とする致命的な致死性心筋炎の発達の研究のための頑強な誘導性モデルとして機能することが最近示されているトランスジェニックマウス株（CD11c.DTR）を使用する。このプロトコルには、心筋炎の誘導、腹腔内アル抗体媒介性細胞染色、器官調製、およびその後のコンピュータ支援画像後処理を伴うLSFMを含む。我々の特定の科学的な問題に高度に適合した方法として提示されているが、プロトコールは、他の臓器および他の種においても全く異なる蛍光構造を標的とすることができる容易に調節可能なシステムの青写真を表す。

提示されたLSFMアプローチは、重篤な心筋炎の誘導時のマウス心臓の白血球分布および量を分析する。 図1Aは、心筋炎誘導のためのトランスジェニックCD11c.DTRマウスの前処理プロトコールを説明する。このステップは、白血球の心筋への動員に必要な引き金を表す。成功したDTX適用の後、動物は、一般的な衰弱、食欲不振、および2〜4日の範囲内の体重減?...

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Quantitative Visualization of Leukocyte Infiltrate in a Murine Model of Fulminant Myocarditis by Light Sheet Microscopy

ここでは、CD11c.DTRマウスの気管内ジフテリア毒素処理によって誘発される、無菌性劇症性心筋炎のネズミモデルにおける心臓のCD45 +白血球浸潤を視覚化するための薄片顕微鏡法を説明する。

光シート顕微鏡による劇症心筋炎のマウスモデルにおける白血球浸潤の定量的可視化

Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), in combination with chemical clearing protocols, has become the gold standard for analyzing fluorescently ...

quantitative-visualization-leukocyte-infiltrate-murine-model

Research

JoVE Journal

Medicine

7.7K ビュー.  University of Duisburg/Essen. ここでは、CD11c.DTRマウスの気管内ジフテリア毒素処理によって誘発される、無菌性劇症性心筋炎のネズミモデルにおける心臓のCD45 +白血球浸潤を視覚化するための薄片顕微鏡法を説明する。 

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A Murine Model of Muscle Training by Neuromuscular Electrical Stimulation

Neuromuscular electrical stimulation (NMES) is a common clinical modality that is widely used to restore1, maintain2 or enhance3-5 muscle functional capacity. Transcutaneous surface stimulation of skeletal muscle involves a current flow between a cathode and an anode, thereby inducing excitement of the motor unit and the surrounding muscle fibers. 
NMES is an attractive modality to evaluate skeletal muscle adaptive responses for several reasons. First, it provides a reproducible experimental model in which physiological adaptations, such as myofiber hypertophy and muscle strengthening6, angiogenesis7-9, growth factor secretion9-11, and muscle precursor cell activation12 are well documented. Such physiological responses may be carefully titrated using different parameters of stimulation (for Cochrane review, see 13). In addition, NMES recruits motor units non-selectively, and in a spatially fixed and temporally synchronous manner14, offering the advantage of exerting a treatment effect on all fibers, regardless of fiber type. Although there are specified contraindications to NMES in clinical populations, including peripheral venous disorders or malignancy, for example, NMES is safe and feasible, even for those who are ill and/or bedridden and for populations in which rigorous exercise may be challenging. 
Here, we demonstrate the protocol for adapting commercially available electrodes and performing a NMES protocol using a murine model. This animal model has the advantage of utilizing a clinically available device and providing instant feedback regarding positioning of the electrode to elicit the desired muscle contractile effect. For the purpose of this manuscript, we will describe the protocol for muscle stimulation of the anterior compartment muscles of a mouse hindlimb.

A murine model of neuromuscular electrical stimulation (NMES), a safe and inexpensive clinical modality, to the anterior compartment muscles is described. This model has the advantage of modifying a readily available clinical device for the purpose of eliciting targeted and specific muscle contractions in mice.

神経筋電気刺激による筋力トレーニングのマウスモデル

Neuromuscular electrical stimulation (NMES) is a common clinical modality that is widely used to restore1, maintain2 or enhance3-5 muscle functional ...

医学

Using Quantitative Real-time PCR to Determine Donor Cell Engraftment in a Competitive Murine Bone Marrow Transplantation Model

Murine bone marrow transplantation models provide an important tool in measuring hematopoietic stem cell (HSC) functions and determining genes/molecules that regulate HSCs. In these transplant model systems, the function of HSCs is determined by the ability of these cells to engraft and reconstitute lethally irradiated recipient mice. Commonly, the donor cell contribution/engraftment is measured by antibodies to donor- specific cell surface proteins using flow cytometry. However, this method heavily depends on the specificity and the ability of the cell surface marker to differentiate donor-derived cells from recipient-originated cells, which may not be available for all mouse strains. Considering the various backgrounds of genetically modified mouse strains in the market, this cell surface/ flow cytometry-based method has significant limitations especially in mouse strains that lack well-defined surface markers to separate donor cells from congenic recipient cells. Here, we reported a PCR-based technique to determine donor cell engraftment/contribution in transplant recipient mice. We transplanted male donor bone marrow HSCs to lethally irradiated congenic female mice. Peripheral blood samples were collected at different time points post transplantation. Bone marrow samples were obtained at the end of the experiments. Genomic DNA was isolated and the Y chromosome specific gene, Zfy1, was amplified using quantitative Real time PCR. The engraftment of male donor-derived cells in the female recipient mice was calculated against standard curve with known percentage of male vs. female DNAs. Bcl2 was used as a reference gene to normalize the total DNA amount. Our data suggested that this approach reliably determines donor cell engraftment and provides a useful, yet simple method in measuring hematopoietic cell reconstitution in murine bone marrow transplantation models. Our method can be routinely performed in most laboratories because no costly equipment such as flow cytometry is required.

Determining donor cell engraftment presents a challenge in mouse bone marrow transplant models that lack well-defined phenotypical markers. We described a methodology to quantify male donor cell engraftment in female transplant recipient mice. This method can be used in all mouse strains for the study of HSC functions.

競争力のあるマウス骨髄移植モデルにおけるドナー細胞の生着を​​決定するために、定量的リアルタイムPCRを用いて

Murine bone marrow transplantation models provide an important tool in measuring hematopoietic stem cell (HSC) functions and determining genes/molecules ...

Murine Model of Wound Healing

Wound healing and repair are the most complex biological processes that occur in human life. After injury, multiple biological pathways become activated. Impaired wound healing, which occurs in diabetic patients for example, can lead to severe unfavorable outcomes such as amputation. There is, therefore, an increasing impetus to develop novel agents that promote wound repair. The testing of these has been limited to large animal models such as swine, which are often impractical. Mice represent the ideal preclinical model, as they are economical and amenable to genetic manipulation, which allows for mechanistic investigation. However, wound healing in a mouse is fundamentally different to that of humans as it primarily occurs via contraction. Our murine model overcomes this by incorporating a splint around the wound. By splinting the wound, the repair process is then dependent on epithelialization, cellular proliferation and angiogenesis, which closely mirror the biological processes of human wound healing. Whilst requiring consistency and care, this murine model does not involve complicated surgical techniques and allows for the robust testing of promising agents that may, for example, promote angiogenesis or inhibit inflammation. Furthermore, each mouse acts as its own control as two wounds are prepared, enabling the application of both the test compound and the vehicle control on the same animal. In conclusion, we demonstrate a practical, easy-to-learn, and robust model of wound healing, which is comparable to that of humans.

A murine model of cutaneous wound healing that can be used to assess therapeutic compounds in physiological and pathophysiological settings.

創傷治癒のマウスモデル

Wound healing and repair are the most complex biological processes that occur in human life. After injury, multiple biological pathways become activated. ...

A Murine Model of Subarachnoid Hemorrhage

In this video publication a standardized mouse model of subarachnoid hemorrhage (SAH) is presented. Bleeding is induced by endovascular Circle of Willis perforation (CWp) and proven by intracranial pressure (ICP) monitoring. Thereby a homogenous blood distribution in subarachnoid spaces surrounding the arterial circulation and cerebellar fissures is achieved. Animal physiology is maintained by intubation, mechanical ventilation, and continuous on-line monitoring of various physiological and cardiovascular parameters: body temperature, systemic blood pressure, heart rate, and hemoglobin saturation. Thereby the cerebral perfusion pressure can be tightly monitored resulting in a less variable volume of extravasated blood. This allows a better standardization of endovascular filament perforation in mice and makes the whole model highly reproducible. Thus it is readily available for pharmacological and pathophysiological studies in wild type and genetically altered mice.

A standardized mouse model of subarachnoid hemorrhage by intraluminal Circle of Willis perforation is described. Vessel perforation and subarachnoid bleeding are monitored by intracranial pressure monitoring. In addition various vital parameters are recorded and controlled to maintain physiologic conditions.

くも膜下出血のマウスモデル

In this video publication a standardized mouse model of subarachnoid  hemorrhage (SAH) is presented. Bleeding is induced by endovascular Circle of  Willis ...

Reproducable Paraplegia by Thoracic Aortic Occlusion in a Murine Model of Spinal Cord Ischemia-reperfusion

Background 
Lower extremity paralysis continues to complicate aortic interventions. The lack of understanding of the underlying pathology has hindered advancements to decrease the occurrence this injury.&#160;The current model demonstrates reproducible lower&#160;extremity paralysis following thoracic aortic occlusion.
Methods 
Adult male C57BL6 mice were anesthetized with isoflurane. Through a cervicosternal incision the aorta was exposed. The descending thoracic aorta and left subclavian arteries were identified without entrance into pleural space. Skeletonization of these arteries was followed by immediate closure (Sham) or occlusion for 4 min (moderate ischemia) or 8 min (prolonged ischemia). The sternotomy and skin were closed and the mouse was transferred to warming bed for recovery.&#160; Following recovery, functional analysis was obtained at 12 hr intervals until 48 hr.
Results 
Mice that underwent sham surgery showed no observable hind&#160;limb deficit. Mice subjected to moderate ischemia for 4 min had minimal functional deficit at 12 hr followed by progression to complete paralysis at 48 hr. Mice subjected to prolonged ischemia had an immediate paralysis with no observable hind-limb movement at any point in the postoperative period. There was no observed intraoperative or post&#160;operative mortality.
Conclusion 
Reproducible lower extremity paralysis whether immediate or delayed can be achieved in a murine model. Additionally, by using a median sternotomy and careful dissection, high survival rates, and reproducibility can be achieved.

The lack of mechanistic understanding of spinal cord ischemia-reperfusion injury has hindered further adjuncts to prevent paraplegia following high risk aortic operations. Thus, the development of animal models is imperative. This manuscript demonstrates reproducible lower extremity paralysis following thoracic aortic occlusion in a murine model.

脊髄虚血再灌流のマウスモデルにおいて胸部大動脈閉塞によって再現可能対麻痺

Background
Lower extremity paralysis continues to complicate aortic interventions. The lack of understanding of the underlying pathology has hindered ...

Noninvasive Assessment of Cardiac Abnormalities in Experimental Autoimmune Myocarditis by Magnetic Resonance Microscopy Imaging in the Mouse

Myocarditis is an inflammation of the myocardium, but only ~10% of those affected show clinical manifestations of the disease. To study the immune events of myocardial injuries, various mouse models of myocarditis have been widely used. This study involved experimental autoimmune myocarditis (EAM) induced with cardiac myosin heavy chain (Myhc)-&#945; 334-352 in A/J mice; the affected animals develop lymphocytic myocarditis but with no apparent clinical signs. In this model, the utility of magnetic resonance microscopy (MRM) as a non-invasive modality to determine the cardiac structural and functional changes in animals immunized with Myhc-&#945; 334-352 is shown. EAM and healthy mice were imaged using a 9.4 T (400 MHz) 89 mm vertical core bore scanner equipped with a 4 cm millipede radio-frequency imaging probe and 100 G/cm triple axis gradients. Cardiac images were acquired from anesthetized animals using a gradient-echo-based cine pulse sequence, and the animals were monitored by respiration and pulse oximetry. The analysis revealed an increase in the thickness of the ventricular wall in EAM mice, with a corresponding decrease in the interior diameter of ventricles, when compared with healthy mice. The data suggest that morphological and functional changes in the inflamed hearts can be non-invasively monitored by MRM in live animals. In conclusion, MRM offers an advantage of assessing the progression and regression of myocardial injuries in diseases caused by infectious agents, as well as response to therapies.

This study demonstrates the successful establishment of magnetic resonance microscopy imaging as a non-invasive tool to assess the cardiac abnormalities in mice affected with autoimmune myocarditis. The data indicate that the technique can be used to monitor the disease-progression in live animals.

マウスでの磁気共鳴イメージング顕微鏡による実験的自己免疫性心筋炎における心臓の異常を非侵襲的に評価

Myocarditis is an inflammation of the myocardium, but only ~10% of those affected show clinical manifestations of the disease. To study the immune events ...

Evaluation of Tumor-infiltrating Leukocyte Subsets in a Subcutaneous Tumor Model

Specialized immune cells that infiltrate the tumor microenvironment regulate the growth and survival of neoplasia.&#160; Malignant cells must elude or subvert anti-tumor immune responses in order to survive and flourish. Tumors take advantage of a number of different mechanisms of immune &#8220;escape,&#8221; including the recruitment of tolerogenic DC, immunosuppressive regulatory T cells (Tregs), and myeloid-derived suppressor cells (MDSC) that inhibit cytotoxic anti-tumor responses. Conversely, anti-tumor effector immune cells can slow the growth and expansion of malignancies: immunostimulatory dendritic cells, natural killer cells which harbor innate anti-tumor immunity, and cytotoxic T cells all can participate in tumor suppression. The balance between pro- and anti-tumor leukocytes ultimately determines the behavior and fate of transformed cells; a multitude of human clinical studies have borne this out. Thus, detailed analysis of leukocyte subsets within the tumor microenvironment has become increasingly important. Here, we describe a method for analyzing infiltrating leukocyte subsets present in the tumor microenvironment in a mouse tumor model. Mouse B16 melanoma tumor cells were inoculated subcutaneously in C57BL/6 mice. At a specified time, tumors and surrounding skin were resected en bloc and processed into single cell suspensions, which were then stained for multi-color flow cytometry. Using a variety of leukocyte subset markers, we were able to compare the relative percentages of infiltrating leukocyte subsets between control and chemerin-expressing tumors. Investigators may use such a tool to study the immune presence in the tumor microenvironment and when combined with traditional caliper size measurements of tumor growth, will potentially allow them to elucidate the impact of changes in immune composition on tumor growth. Such a technique can be applied to any tumor model in which the tumor and its microenvironment can be resected and processed.

This protocol describes a method for the detailed evaluation of leukocyte subsets within the tumor microenvironment in a mouse tumor model. Chemerin-expressing B16 melanoma cells were implanted subcutaneously into syngeneic mice. Cells from the tumor microenvironment were then stained and analyzed by flow cytometry, allowing for detailed leukocyte subset analyses.

皮下腫瘍モデルにおける腫瘍浸潤白血球サブセットの評価

Specialized immune cells that infiltrate the tumor microenvironment regulate the growth and survival of neoplasia.&#160; Malignant cells must elude or ...

Evaluation of Lung Metastasis in Mouse Mammary Tumor Models by Quantitative Real-time PCR

Metastatic disease is the spread of malignant tumor cells from the primary cancer site to a distant organ and is the primary cause of cancer associated death 1. Common sites of metastatic spread include lung, lymph node, brain, and bone 2. Mechanisms that drive metastasis are intense areas of cancer research. Consequently, effective assays to measure metastatic burden in distant sites of metastasis are instrumental for cancer research. Evaluation of lung metastases in mammary tumor models is generally performed by gross qualitative observation of lung tissue following dissection. Quantitative methods of evaluating metastasis are currently limited to ex vivo and in vivo imaging based techniques that require user defined parameters. Many of these techniques are at the whole organism level rather than the cellular level 3-6. Although newer imaging methods utilizing multi-photon microscopy are able to evaluate metastasis at the cellular level 7, these highly elegant procedures are more suited to evaluating mechanisms of dissemination rather than quantitative assessment of metastatic burden. Here, a simple in vitro method to quantitatively assess metastasis is presented. Using quantitative Real-time PCR (QRT-PCR), tumor cell specific mRNA can be detected within the mouse lung tissue.

This protocol describes how to use quantitative Real-time PCR (QRT-PCR) to detect tumor cell specific mRNA representing metastasis within the mouse lung tissue.

定量的リアルタイムPCRによるマウス乳腺腫瘍モデルにおける肺転移の評価

Metastatic disease is the spread of malignant tumor cells from the primary cancer site to a distant organ and is the primary cause of cancer associated ...

Reproducible Arterial Denudation Injury by Infrarenal Abdominal Aortic Clamping in a Murine Model

Percutaneous vascular interventions uniformly result in arterial denudation injuries that subsequently lead to thrombosis and restenosis. These complications can be attributed to impairments in re-endothelialization within the wound margins. Yet, the cellular and molecular mechanisms of re-endothelialization remain to be defined. While several animal models to study re-endothelialization after arterial denudation are available, few are performed in the mouse because of surgical limitations. This undermines the opportunity to exploit transgenic mouse lines and investigate the contribution of specific genes to the process of re-endothelialization. Here, we present a step-by-step protocol for creating a highly reproducible murine model of arterial denudation injury in the infrarenal abdominal aorta using external vascular clamping. Immunocytochemical staining of injured aortas for fibrinogen and &#946;-catenin demonstrate the exposure of a pro-thrombotic surface and the border of intact endothelium, respectively. The method presented here has the advantages of speed, excellent overall survival rate, and relative technical ease, creating a uniquely practical tool for imposing arterial denudation injury in transgenic mouse models. Using this method, investigators may elucidate the mechanisms of re-endothelialization under normal or pathological conditions.

Understanding the cellular and molecular mechanisms of re-endothelialization following arterial denudation injury is of paramount importance in preventing thrombosis and restenosis of arteries. Here we describe a protocol for reproducible arterial denudation injury of the infrarenal abdominal aorta. The procedure was developed to investigate the underlying mechanisms that regulate endothelial regeneration using mouse models.

マウスモデルにおける下腹部大動脈クランプすることにより、再現性動脈侵食に起因けが

Percutaneous vascular interventions uniformly result in arterial denudation injuries that subsequently lead to thrombosis and restenosis. These ...

Intravital Microscopy of Monocyte Homing and Tumor-Related Angiogenesis in a Murine Model of Peripheral Arterial Disease

The therapeutic goal for peripheral arterial disease and ischemic heart disease is to increase blood flow to ischemic areas caused by hemodynamic stenosis. Vascular surgery is a viable option in selected cases, but for patients without indications for surgery such as progression to rest pain, critical limb ischemia, or major disruptions to life or work, there are few possibilities for mitigating their disease. Cell therapy via monocyte-enhanced perfusion through the stimulation of collateral formation is one of a few non-invasive options.
Our group examines arteriogenesis after monocyte transplantation into mice using the hindlimb ischemia model. Previously, we have demonstrated improvement in hindlimb perfusion using tetanus-stimulated syngeneic monocyte transplantation. In addition to the effects on the collateral formation, tumor growth could be affected by this therapy as well. To investigate these effects, we use a basement membrane-like matrix mouse model by injecting the extracellular matrix of the Engelbreth-Holm-Swarm sarcoma into the flank of the mouse, after occlusion of the femoral artery.
After the artificial tumor studies, we use intravital microscopy to study in vivo tumor-angiogenesis and monocyte homing within collateral arteries. Previous studies have described the histological examination of animal models, which presupposes subsequent analysis to post-mortem artifacts. Our approach visualizes monocyte homing to areas of collateralization in real time sequences, is easy to perform, and investigates the process of arteriogenesis and tumor angiogenesis in vivo.

Monocytes are important mediators of arteriogenesis in the context of peripheral arterial disease. Using a basement membrane-like matrix and intravital microscopy, this protocol investigates monocyte homing and tumor-related angiogenesis after monocyte injection in the femoral artery ligation murine model.

光シート顕微鏡による劇症心筋炎のマウスモデルにおける白血球浸潤の定量的可視化

要約

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神経筋電気刺激による筋力トレーニングのマウスモデル

競争力のあるマウス骨髄移植モデルにおけるドナー細胞の生着を決定するために、定量的リアルタイムPCRを用いて

創傷治癒のマウスモデル

くも膜下出血のマウスモデル

脊髄虚血再灌流のマウスモデルにおいて胸部大動脈閉塞によって再現可能対麻痺

マウスでの磁気共鳴イメージング顕微鏡による実験的自己免疫性心筋炎における心臓の異常を非侵襲的に評価

皮下腫瘍モデルにおける腫瘍浸潤白血球サブセットの評価

定量的リアルタイムPCRによるマウス乳腺腫瘍モデルにおける肺転移の評価

マウスモデルにおける下腹部大動脈クランプすることにより、再現性動脈侵食に起因けが

単球のホーミングと末梢動脈疾患のマウスモデルにおける腫瘍関連血管新生の生体顕微鏡

光シート顕微鏡による劇症心筋炎のマウスモデルにおける白血球浸潤の定量的可視化

要約

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神経筋電気刺激による筋力トレーニングのマウスモデル

競争力のあるマウス骨髄移植モデルにおけるドナー細胞の生着を​​決定するために、定量的リアルタイムPCRを用いて

創傷治癒のマウスモデル

くも膜下出血のマウスモデル

脊髄虚血再灌流のマウスモデルにおいて胸部大動脈閉塞によって再現可能対麻痺

マウスでの磁気共鳴イメージング顕微鏡による実験的自己免疫性心筋炎における心臓の異常を非侵襲的に評価

皮下腫瘍モデルにおける腫瘍浸潤白血球サブセットの評価

定量的リアルタイムPCRによるマウス乳腺腫瘍モデルにおける肺転移の評価

マウスモデルにおける下腹部大動脈クランプすることにより、再現性動脈侵食に起因けが

単球のホーミングと末梢動脈疾患のマウスモデルにおける腫瘍関連血管新生の生体顕微鏡

競争力のあるマウス骨髄移植モデルにおけるドナー細胞の生着を決定するために、定量的リアルタイムPCRを用いて