この手順の全体的な目標は、パーキンソン病の本質的な側面のほとんどを動物モデルで再現することである。アデノ随伴ウイルスベクターの定位送達では、黒質中のヒトシヌクレインをコードする。パーキンソン病は、黒質線条体経路におけるドーパミン作動性ニューロンの死、および結果として随意運動の制御喪失の進行を伴う神経変性障害である。
この神経変性プロセスは、主にシヌクレインによって構成されている脳内のタンパク質凝集体の沈着によって伴われる。新たな証拠は、シヌクレイン凝集体がミクログリア上のトール様受容体を刺激し、したがって黒質における神経炎症を引き起こす可能性があることを示している。さらに、証拠は、シヌクレイン凝集体を捕捉および提示することができ、T細胞に抗原提示細胞によって、シヌクレインに特異的な適応免疫応答を誘導することができることを示す。
黒質におけるヒトシヌクレインをコードするアデノ随伴ウイルスベクターの定位送達は、シヌクレイン病理、ミクログリア活性化、T細胞活性化、神経変性、および運動障害を含む疾患の多くの本質的な側面を再現することが示されている。本研究は、ウイルスベクターおよびウイルスベクター送達後の時間が、黒質線条体経路におけるヒトシヌクレイン発現、神経変性および神経炎症の程度、ならびに黒質におけるヒトシヌクレインの一方的定位送達のマウスモデルにおける運動障害の程度にどのように影響するかの分析を提示する。無菌環境を維持するために、手術中は、靴カバー、手術用マスク、衛生バリア、手袋、手術帽など、適切な手術用服を着用してください。
マウスおよびすべての手術材料にエタノールを噴霧し、無菌環境を維持する。鎮痛を誘発するには、カルプロフェンを12時間ごとに皮下注射し、手術の1時間前から、手術後3日まで続けます。マウスを麻酔するには、動物を誘導チャンバーに入れます。
イソフルランの流れを0.5%の割合で開き、マウスが右反射を失うまで約5分間かけてゆっくりと5%まで増加させます。誘導チャンバーから動物を取り外します。直ちに動物を適切な大きさの鼻円錐形を備えた非再呼吸回路に移す。
手術の全時間を通してイソフルラン1%でマウス麻酔を維持する。マウスの尾と足をつまんで完全に麻酔をかけていることを確認します。尻尾と足をつまんでもマウスが反応しない場合は、マウスが完全に麻酔をかけられていることを意味します。
はさみを使ってマウスの頭を剃ります。クロルヘキシジン2%の綿棒を使用してマウスの皮膚をきれいにし、すべての髪を取り除きます。マウスヘッドを定位フレームに固定します。
角膜保護剤をマウスの両眼に置き、綿棒を用いた。他のげっ歯類のストレス誘発を防ぐために、手術室に他のマウスがいないことを避けてください。クロルヘキシジン2%に続いてエタノール70%の3ラウンドでマウスの頭をきれいにし、外科用材料を使用して頭蓋骨を露出させ、内側線に対して前後座標2.8mm、および中側1.4mmのドリルで細い穴を開ける。
10マイクロリットルの注射器の針を穴に入れ、硬膜に対して7.2mmの背腹側に到達するまで、脳内の針をゆっくりと動かす。組織が少し落ち着くように針を最終位置に2分間放置し、次いで30秒ごとに0.2マイクロリットルの割合で、1マイクロリットルのウイルスベクターを右黒質に注入する。ウイルスベクターの送達後5分間針を同じ位置に放置し、その後ゆっくりと引き抜く。
滅菌シルク縫合糸を用いて創傷を閉じる。マウスを家庭用ケージに入れ、電気式暖かいマットレスの上に置いて事前に温めます。定位手術の12週間後、前に説明したビーム試験の簡略化されたバージョンを使用して、運動性能を評価する。
このためには、長さ25cm、幅3cmの水平ビームを使用してください。ビーム表面は、1センチメートルの正方形の金属グリッドで覆われ、ビームから1センチメートル高くなければなりません。グリッドサーフェスビームを横断しながら、ホームケージがあるビームの一方の端から反対側の端まで、マウスのビデオを作成します。
運動性能の決定の前に、マウスを2日間訓練する。初日に、グリッドなしでビームを5回歩くようにマウスを訓練します。2日目に、グリッドの存在下でビームを5回歩くようにマウスを訓練します。
3日目に、運動性能を評価する。これを行うには、スローモーションモードでビデオを見ることによって、左足または右足によって別々に実行されたエラーの数を定量化します。マウスを麻酔するには、ケタミンとキシラジンの混合物を腹腔内に注射する。
マウスが完全に麻酔されたら、手術材料で胸郭を開き、心臓を露出させる。次に、心臓の左心室に平らな先端の針を挿入します。針をパイプに結合することにより、蠕動ポンプを用いて、毎分9.5ミリリットルの速度で、50ミリリットルのリン酸緩衝液生理食塩水を灌流する。
はさみとピンセットを使用して脳を取り除き、リン酸緩衝液生理食塩水に5ミリリットルの4%パラホルムアルデヒドを浸漬して固定します。その後、固定された脳を30%スクロースの15ミリリットルに48時間入れる。その後、脳を4ミリリットルの凍結保護溶液に入れ、脳を80度で保存するか、次のステップですぐに使用してください。
線条体スライスを得るには、脳を厚さ40マイクロメートルのセクションに切断し、1.34mmから始まり、0.26mmで仕上げる。各スライスを2ミリリットルのクライオチューブで収穫し、前後の順序に従います。線条体における免疫組織化学的および免疫蛍光学的分析を行うには、核の吻側尾部全体をカバーする5つの冠状線条体切片を均一な間隔で採取する。
黒質線条体経路のドーパミン作動性ニューロンにおけるウイルスベクターの正しい送達を検証するために、GFPをコードするベクターを注射し、黒質において、および12週間後に、GFP蛍光およびチロシンヒドロキシラーゼの免疫蛍光による黒質および線条体における免疫反応性を分析した。GFP関連蛍光は、もっぱら同側部位に位置し、黒質および線条体の両方で免疫反応性のチロシンヒドロキシラーゼとの有意な共局在が観察され、黒質線条体経路のドーパミン作動性ニューロンにおけるウイルスベクターの正しい送達を示す。必要なシヌクレインをコードするベクターの用量を試験するために、ニグラルドーパミン作動性ニューロンの神経変性を促進するヒトシヌクレインの有意な過剰発現を誘導するために、異なる用量のベクターを注入した。
そして12週間後、ヒトシヌクレイン免疫反応性、およびチロシンヒドロキシラーゼ免疫反応性の程度を、黒質線条体経路において試験した。ヒトシヌクレインの免疫反応性は明らかであり、すべての用量を黒質で試験した。しかしながら、マウス当たり10〜10個のウイルスゲノムを受けたマウスのみが、線条体において明らかなヒトシヌクレイン免疫反応性を示した。
ヒトシヌクレインをコードするベクターのマウス当たり10〜10個のウイルスゲノムを受容したマウスは、黒質におけるドーパミン作動性ニューロンの有意な喪失を示した。GFPをコードするベクターの同じ用量を受けたマウスは、低程度のニューロン喪失を示したが、これらのマウスは、ヒトシヌクレインをコードするベクターを受容したマウスと比較して、有意に低い程度の神経変性を示した。ビーム試験を用いて、ヒトシヌクレインをコードするベクターのマウス当たり10〜10個のウイルスゲノムを受容し、右足と左足によってなされたエラーの数を比較するとき、またはエラーの総数を比較するとき、ヒトシヌクレインをコードするベクターを受容したマウスにおいて、運動性能の有意な低下が排他的に検出され、 それらのマウスが制御ベクターを受け取る。
ヒトシヌクレイン発現の発症を定義するために、マウスを、マウス1匹当たり10〜10個のウイルスゲノム、ヒトシヌクレインをコードするベクター、または偽手術で処置し、ヒトシヌクレイン発現の程度を、週1回、定位手術後2〜5週間の間に黒質で分析した。結果は、ヒトのシヌクレイン発現が定位手術後の5週目に明らかになり始めたことを示している。ミクログリア活性化のピークを決定するために、高レベルのIba1を発現する細胞の程度を、マウスの線条体において、手術後2〜15週の間に定量した。
結果は、ウイルス接種後15週間のマウスの対側側と比較して、同側側のミクログリア活性化の有意な増加を示す。実質的な黒質に浸潤した制御性T細胞の数を異なる時点で分析し、免疫蛍光による定位手術を行った後、共焦点顕微鏡観察を行った。黒質への制御性T細胞浸潤のピークは、手術後11週目に観察された。
ここで解析した神経変性のマウスモデルは、パーキンソン病の病態生理学における多数の重要な側面関与を研究するのに有用なモデルを表す。シヌクレイン病態に関与するメカニズム、ミクログリア活性化、末梢免疫系の関与、神経炎症、および神経変性のメカニズムに関与するアデノ随伴ウイルスベクターの適切な用量であって、神経変性、神経炎症、T細胞浸潤、および運動障害を誘導するヒトシヌクレインをコードするサブタイプ5種は、マウス1匹あたり10~10個のウイルスゲノムである。この研究は、定位手術の5週間後に、ヒトシヌクレイン発現がすでに明らかであったが、この動物モデルに運動障害がない場合に、重要な時点を構成することを示している。
これにより、この時点は、興味深い時間的点を表し、神経炎症および神経変性の進行を止めるように調整された実験的療法の投与を開始する。この動物モデルにおける神経炎症を分析するのに最も適した時点は、定位手術後の15週目である。中枢神経系へのT細胞浸潤を分析するのに適切な時点でありながら。
ウイルスベクター接種後11週目にあると思われる。
