This research was supported by the Robert A. and Rene E. Belfer Family Foundation, NIA R21 AG038856 (JLJ), BrightFocus Foundation Alzheimer&#8217;s Disease research grant A2010097 (JLJ), and NIA Biology of Aging Training grant T32 AG000183 (support for SDG).

実験動物の管理と使用のための健康ガイドの国立研究所に従って動物を含むすべての手続きとプロトコルを実行します。ここで説明する手順を見直し、医療施設内動物管理使用委員会のベイラー医科大学によって承認された。 齧歯類の脳における導入遺伝子の送達のための複製不能アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターは、生物学的安全性レベル1の使用が承認されている。適切な保護やウイルスの取り扱い手順についての具体的な要件について詳しく説明し、「微生物学および生物医学研究所（BMBL）におけるバイオセーフティ &quot;米国政府の出版のためのCDCのウェブサイトを参照してください。ウイルスを用いた手順のための制度固有の要件を学ぶために地元の獣医と環境安全スタッフに確認してください。手続き室、検疫、およびバイオハザードケージの識別に関する規程は教育機関ごとに異なる​​。 1。前P0仔と養母を削減する<ol><li>すべての妊婦および授乳雌は繁殖および授乳のエ​​ネルギー需要をサポートするために、高脂肪食を提供します。 </li><li>夜には、単一の居住者の男性のケージに1つまたは2つの健康な女性のを追加して飼育ケージを設置。翌朝は、差込みプラグ用​​のメスをチェックし、プラグが存在する場合には、男性から、女性を分離する。 <ol><li>貧しい母親の特性（例えば、C57BL / 6またはC3HeJ）との遺伝的背景から子犬を上げるために養母を使用してください。転送子犬が養母自身のごみの4日以内に生まれた場合は、フォスターの母親は、他のゴミから子犬を受け入れる。 </li><li>メス2組のほぼ同時に配信するように実験的なブリーダーと並んで、ICRまたはFVBメスを使用して個別の交配ケージをセットアップします。 </li></ol></li><li>女性はバックグラウンド系統に応じて、プラグ日から19±1日でお届けします。 3日前からd（16日プラグ日以降）eliveryは、新鮮なネスティング材料と覆われた避難所で清潔なケージに妊娠中の女性を配置します。 </li><li>一日二回出産予定日の2日前（17日プラグ日以降に）開始する新生児のために確認してください。ピンク新生児の存在について、底部を通ってかいま見ることで母親に最小応力とケージを確認します。マウスは、一般的には午後にお届けします午前中が、まれに子犬をお届けします。 </li><li>子犬、またはいずれか早い方の誕生の6時間内（可視ミルクスポットによって明らかになる）介護されるとすぐに注射を実行するように計画します。 </li></ol> 2注射用機器を準備する<ol><li>一般のP0新生児用32 G針を10μlの注射器を準備します。定位噴射を行う場合は、マニピュレータアームの上にシリンジをマウントします。 </li><li>注射用の定位フレームを使用している場合、100％のエタンを追加して4-8℃に新生児のステージを冷却オールおよびブロックの先端のリザーバにドライアイス。仔の凍傷を避けるために、1℃以上の温度を維持する。 </li></ol> 3注射用のウイルス希釈液を調製する<ol><li> 1％トリパンブルー染料溶液（20×ストック）を準備します。 </li><li>クラス2バイオセーフティキャビネット内にアデノ随伴ウイルス（AAV）株式の5-25μlのアリコートを準備します。将来の使用のために-80℃でこれらの分量を配置します。これはウイルスが形質導入の有効性を失う原因となるような追加の凍結融解は避けてください。 </li><li>解凍する氷上で-80℃の冷凍庫と場所からのAAVの分量を削除します。 </li><li>氷冷した1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）中にウイルスを希釈して注射のためにウイルス溶液を調製する。形質導入パターンの初期最適化のための10倍連続希釈（10月10日から8月 10日までのウイルス粒子/半球）から開始します。 </li><li> 0.05％の最終濃度までAAV溶液に20倍のトリパンブルーを追加する。 </li></ol><pクラス= &quot;jove_title&quot;&gt; 4。注射用新生児のステージング<ol><li>冷却するために氷の上の小さなアルミ板を配置します。ドライタスク冷たい金属から子犬の皮膚を保護するために、プレートの上に拭きを置きます。これは子犬を麻酔し、注入するための平坦な冷たい面となっている。 </li><li>注射の前と後の温かい新生仔マウスを維持するのに適した温暖化パッドを準備します。 </li><li>新生児の看護師に始まったら、ケージからそれらの約半分を削除し、その母親と一緒に残りの半分を残す。注射を待つ間加温パッド上で収集子犬を置きます。 注：生物学的な母親が子犬の世話をしない場合は、すぐにケージから全体ゴミを除去し、注入を待つために加温パッド上に子犬を置く。この状況は、C57BL / 6雌とか、貧弱な繁殖特性を持つ他の近交系を持って生まれて最初のごみを生じる可能性がある。この状況では、牛乳のスポットは新生児に表示されません。 </li><li>低体温麻酔を誘導するために、コールド金属板上に温暖化パッドから1子犬を転送します。子犬が完全に麻酔をかけたになるのを2〜3分待ちます。非常に静かに足を絞ることによって麻酔を確認し、動きや呼吸の不足を監視します。 </li></ol>新生児マウスにAAVの5。注射<ol><li>フリーハンド新生児マウスへのAAVの頭蓋内注射： <ol><li>注射器にロード0.05％トリパンブルーで希釈されたAAVの5μlの。 </li><li>静かに70％エタノールに浸した綿棒で麻酔をかけた子犬の頭を拭く。 </li><li>それぞれの目のラムダ縫合糸からの距離の2月5日で、注射部位を特定します。代わりの注射部位は、約0.8〜1ミリメートルを半ラムダとブレグマとの間で、矢状縫合から側方に位置しています。これらのランドマークは、P0で、皮膚を通して見ることができます。 </li><li>非毒性実験室ペン注射部位をマークする。 </li><li> MONIのための目に見えるスケールで注射器を持ち分配され、溶液の量をtoring。 </li><li>親指がプランジャのトップに到達できることを確認してください。誤ってウイルスを分配避けるために針を配置しながら、プランジャーから親指を削除します。 </li><li>アイスバケットに腕をベンチに肘を置くと傾斜させて注入するためのアームをブレースに快適な位置を検索します。 </li><li>直接注射器の下に頭を横に子犬を置きます。マークされた注射部位が上に向くように子犬の頭を回し、静かにしっかり開いた手でこの位置を保持する。 </li><li>頭蓋骨の表面に垂直な注射器を持ち、約3mmの深さにマークされた注射部位に注射針を挿入します。抵抗は、針が側脳室に浸透したことを示す、わずかに減少するまで、針を注入する。参照が必要な場合は、非毒性メーカー付きの針の先端から3mmをマーク。染料tに基づいて、子犬の大きさと歪みのための注入深さを調整します心室のargeting。 </li><li>プランジ​​ャが脳に遠くに針を動かすことなく押すことができるように、しっかりと注射器を持ってください。注射は視床に変位すると、ウイルスの拡散が厳しく制限される。 </li><li>注射器から分配量を監視しながら、ゆっくりとウイルスを注入することから始めます。各心室に2μlに最大音量を管理します。針が正しい位置にある場合、色素は心室を埋めるために広がっていく。 </li><li>ゆっくりと針を撤回。 </li><li>最初の注射部位は、他の半球を注入する前に閉じるようにします。 注：複数回同じ部位に注入しないでください。すでに漏れるために注入し、子犬の負傷や死亡の原因とされている針の力ウイルスを再挿入。 </li><li>同じ手順を使用して反対側の心室を注入する。 </li></ol></li><li>新生仔マウスへのAAVの定位注射： <ol><li> 0.05％トリパンブルーのintで希釈されたAAVの負荷を5μl定位マニピュレータが保有する注射器O。 </li><li>静かに新生児のフレームの耳バーの間子犬の頭を置く。ヘッドはラムダとブレグマの間の線がステージに平行であることをチェックすることにより、Y軸（前から後ろ）にレベルであることを確認してください。ことを耳や目の間の線間の想像線をチェックすることで（左右に）頭をX軸でのレベルであることを確認し、ステージに平行である。 </li><li>静かに70％エタノールに浸した綿棒で、麻酔した子犬の頭を拭く。 </li><li>ラムダ上記注射器を位置決めするために、定位マニピュレータを使用し、XおよびY座標をゼロ。標準P0仔のための（X、Y）=（0.8、1.5）mmの定位腕を移動します。 注：子犬の大きさと定位座標は、歪みや年齢によって異なる場合があります。側脳室をターゲットにするために、必要に応じて色素の注射に基づいて座標を調整します。 </li><li>ゆっくりと注射部位に針を下ろします。頭蓋骨の表面は、indはしますENT、その後、針が皮膚を貫通した後に解放する。頭蓋骨が通常の凹形状を回復するまで、針を後退させるが、皮膚下に針のベベルを保つ。ゼロZは、この時点で座標です。 </li><li> Z = -1.7ミリメートルまで針を挿入し、-1.5 mmまで後退する。 </li><li>ゆっくりとウイルスを注入します。各半球は溶液2μlまで受け入れることができます。 </li><li>注入が完了した後に30〜60秒の場所に注射器を保管した後、ゆっくりと1〜2分間かけて、針を後退させる。 </li><li>注射部位のX軸に負の座標を使用して、対側半球に対して繰り返します。 注：注射のための代替座標は（X、Y、Z）=（0.8、2.0、-1.5）mmで（1.2、1.0、-1.5）mmである。 （0.8、2.0）での最初の注射を行った後、最終的には（0.8、-2.0）、（1.2、1.0）と（1.2、-1.0）に移動する。半球あたり2μlの合計で、各サイトで溶液1μlを注入。レの手順を完了するために、注射の間で迅速に移動します10分を超える秒。 </li></ol></li></ol> 6。ポスト噴射ケア<ol><li>両半球に注射を完了した後、正常にその体温や皮膚の色戻るまで加温パッドの上に子犬を後ろに置き、子犬が動き始める。 </li><li>注入された新生児を看護する実母を使用している場合、彼らは通常の移動を回復した後、生物学的な母親に注入された子犬を返します。温暖化パッド上に残っている未注射子犬を置きます。すべてのマウスが注入されるまで、手順を繰り返します。 </li><li>注入された新生児を看護する里親のお母さんを使用する場合、それらは通常の移動を回復した後に、ケアのために養母に注入されたすべての仔を転送します。 <ol><li>注入された動物の成功を確実にするために大部分またはケージから養母に所属仔のすべてを削除します。 </li><li>養母の子犬と注入された子犬は、同じ目や皮膚の色を持っている場合、彼らがすることができるので、実験室のペンで養母から子犬をマーク後で区別した。 </li><li>養母の子犬と注入された子犬と一緒に自分の寝具の一部を配置します。注入された子犬が新しい子犬の受け入れを向上させるために、彼女の生物学的子孫の香りを取得していることを確認してください。 </li><li>バック養母のケージにのみ注入された子犬を置きます。養母から残っている子犬を間引く。 </li></ol></li><li>母親がに出席し、ケージにそれらを配置する10分以内に注入された子犬を看護していることを確認します。母親はこの時間内に子犬を収集しない場合は、別の養母に子犬を転送します。 </li><li>それは、ウイルスを注射した動物が含まれていることを示すためにバイオハザードカードを使ってケージにラベルを付けます。ハウス72時間認定された場所にケージ。 </li><li> 72時間の検疫期間の後、清潔なケージに母と仔（ただし寝具やその他のケージ項目）を転送します。いずれのウイルスに汚染された寝具への露出を避けるために、レベル2のバイオセーフティキャビネット内のこの転送を実行します。 R通常のマウス施設に注入された動物できれいにケージをeturn。 </li><li> 、バイオハザードバッグに汚れたケージを置いてオートクレーブで滅菌した後、飼育ケージに戻します。 </li></ol> 7クリーンアップ<ol><li>将来の使用のために4℃で、残りのウイルス液を配置します。 4℃8で保存した場合、ウイルスは、少なくとも2ヶ月間、導入効率を保持します。 </li><li>脱イオン水中に繰り返さリンスに続いて、2％の漂白剤と注射針と注射器を消毒。 </li><li> 70％エタノールに続いて、2％の漂白剤とワーキングエリアを清掃してください。 </li><li>プラスチック製バイオハザードバッグに入れピペットチップ、チューブ、マスク、手袋を含むすべて使い捨てのアイテムを収集します。現地の法律や制度の方針（ すなわちオートクレーブまたは焼却）で必要とされる廃棄物を処分。 </li></ol> 8。イメージングのためのマウスの脳を準備<ol><li> 3-で二酸化炭素の安楽死チャンバ内に注射したマウスを置きます4週間後に注射。適切な安楽死の手順については、施設のガイドラインに従ってください。これは蛍光標識を消光するようホルムアルデヒドで動物を灌流しないでください。 </li><li>頭蓋骨から脳全体を取り出し、4℃でPBS中の4％パラホルムアルデヒド中で3-12時間、固定します。 </li><li>凍結保護のため30％ショ糖に固定された脳を転送します。脳が底に沈むまで4℃でインキュベートする。 </li><li>細かく砕いたドライアイスの入ったバケツを収集します。正中線の下半分に、脳をカットします。凍結し、ドライアイスで脳の半分を埋める。 </li><li>ドライアイスおよび100％エタノールを添加することによりミクロトームステージを冷却する。 </li><li> PBSを用いてダウン正中でステージに脳を固定し、凍結することができます。 </li><li>凍結スライディングミクロトームを用いて、30〜45ミクロンの厚さで脳の断面。 </li><li>不凍液（250ミリリットルのグリセロールを300mlのエチレングリコールを500mlの0.1Mリン酸緩衝液、pH7.4）を含む24ウェルプレートに置き部。カバープレートのWi将来の使用のために-20℃で、第スズ箔とストア。 </li><li> 1-4井戸からのセクションを収集し、PBS中で3回洗う。 </li><li>顕微鏡スライドとカバーガラスの上のセクションをマウントします。スライドは、暗い場所で乾燥することができます。 </li><li>ネイティブYFPまたはtdTomatoのための適切なフィルタを用いた画像スライドは、ウイルス形質導入パターンを確認します。 </li></ol>

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</ol>

著者は、彼らが競合する金融利害がないことを宣言します。

私たちは、新生児マウスの脳に広範に送達するためのビヒクルとしてAAVを使用して、ニューロン遺伝子発現を操作するための汎用性の手順を記載している。そのような子宮内電気穿孔1または定位頭蓋内注射2,3のように、神経細胞の遺伝子導入する他の方法と比較して、新生児のウイルス注射は、比較的簡単でシンプルです。基本的な手順は、アイスバケット及びマイクロシ?...

神経遺伝子発現を改変するための従来の方法は時間がかかり、高価な生殖系列操作を必要とする。そのような子宮内エレクトロポレーションまたは定位レンチウイルス注入収量のように新たにアプローチより速く結果オルタナティブかつ低コストであるが、複雑な外科的介入1-3必要とするという欠点を持っている。さらに、導入遺伝子の発現は、これらの方法に制限された空間範囲を有する。本明細書では、新生児マウスの脳へのアデノ随伴ウイルス（AAV）の脳室内注射を介して広範な神経細胞操作のための、迅速、簡単、かつ経済的な方法を記載する。方法はまず、AAVは、それが未成熟上衣障壁を通って脳実質4に側脳室からの経過とともにそれは脳脊髄液内に拡散させてから、それらが小さな粒径を示唆2001年にジョン·ウルフとマルコPassiniによって記述された5。 F内のAAVの室内注射IRST誕生利回り嗅球から脳幹6,7に、脳のあらゆる領域に及ぶ神経サブセットの普及ウイルス形質導入後24時間。ウイルスにより配信の導入遺伝子を発現させ、注射日以内にアクティブで、形質導入後の年まで持続している。このように、この多目的な操作は、生後初期の脳の発達から成人老化および変性に至るまでの研究を可能にします。 それはニューロン6の形質導入で最も効率的であるため、私たちの具体的な実験のニーズに技術を適応では、主にAAV8血清型に焦点を当てている。私たちは、ウイルス力価は、遺伝子操作の細胞固有の影響を試験する実験のために形質導入​​された神経細胞の密度を制御するために希釈することができることを示している。また、2つのウイルスがために選択された血清型に依存して、ニューロンの別個のまたは重複するセットに向けて付勢されている発現パターンを生成するために同時注入することができたことを実証ウイルスパッケージ。私たちの仕事は、実験的な神経科学の設定の広い範囲で使用するためのこの技術の汎用性を拡大する。

<table><tbody><tr><td>ICR outbred mice</td><td>Harlan</td><td>Hsd:ICR (CD-1)</td><td>This strain is also known as CD-1</td></tr><tr><td>FVB inbred mice</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>1800</td><td>5-6 weeks of age</td></tr><tr><td>Nestlets</td><td>Lab Supply</td><td>NESTLETS</td><td></td></tr><tr><td>Shepherd shacks</td><td>Lab Supply</td><td>SS-mouse</td><td></td></tr><tr><td>High fat rodent chow</td><td>Purina Mills</td><td>PicoLab Mouse diet 20, #5058</td><td>This is our standard breeder chow</td></tr><tr><td>High fat rodent chow (alternative)</td><td>Harlan Laboratories</td><td>Teklad Global 19% protein rodent diet #2019S</td><td>If low phytoestrogen, autoclavable diet is needed</td></tr><tr><td>Injection syringe</td><td>Hamilton</td><td>7653-01</td><td>10 ml syringe</td></tr><tr><td>Injection needles</td><td>Hamilton</td><td>7803-04, RN 6PK PT4, 0.375&quot;</td><td>32 G, for standard P0 injections</td></tr><tr><td>Metal plate for cryoanesthesia</td><td>McMaster Carr</td><td>8975K439</td><td>Raw aluminum plate, 6&amp;rdquo; x 12&amp;rdquo;, 0.25&amp;rdquo; thick, will need to be cut into 3 equal pieces and edges sanded by local machine shop</td></tr><tr><td>Small animal stereotaxic device with digital readout</td><td>David Kopf Instruments</td><td>Model 940</td><td></td></tr><tr><td>Universal syringe holder with needle support foot</td><td>David Kopf Instruments</td><td>Model 1772-F1</td><td></td></tr><tr><td>Neonatal frame</td><td>Stoelting</td><td>51625</td><td>Officially called a mouse and neonatal rat adaptor</td></tr><tr><td>Biohazard disposal bags with sterile indicator</td><td>VWR</td><td>14220-030</td><td>Important! &amp;ndash; Check with local veterinary and environmental safety staff to learn your institute&amp;rsquo;s protocol for biohazard waste disposal</td></tr></tbody></table>

intracerebroventricular viral injection of the neonatal mouse brain for persistent and widespread neuronal transduction

科学の進歩のペースが急速に加速してして、新たな方法を迅速かつ簡単にマウス脳における遺伝子発現を操作するために実験的な神経科学のために必要とされる。ここでは、最初の新生児マウスの脳内へのウイルスによりコード導入遺伝子の直接の頭蓋内送達のためにPassiniとウルフによって導入された技術について説明します。最も基本的な形態では、手順は、アイスバケットとマイクロリットルシリンジを必要とします。しかし、プロトコルは、技術の新たな研究者のための一貫性を改善するために、定位固定フレームとの使用に適合させることができる。この方法は、上衣ライニングは、出生後の最初の12〜24時間の間、まだ未熟である間脳実質への脳室から自由に移動するためのアデノ随伴ウイルス（AAV）の能力に依存しています。脳全体の神経細胞の広範な伝達におけるこの年齢の結果でのAAVの室内注射。発現は、注射の日以内に始まり、lifetim持続動物のメール。蛍光タンパク質の共発現は、形質導入細胞の重要なラベルを提供しながら、ウイルス力価は、形質導入されたニューロンの密度を制御するように調節することができる。既製の両方を提供するために、ウイルスコア施設、事前包装された試薬およびカスタムウイルス調製物の立ち上がり可用性と、このアプローチは、迅速、簡単、かつはるかに安価であるマウス脳における遺伝子発現を操作するためのタイムリーな方法を提供伝統的な生殖細胞工学より。

成功した脳室内ウイルス注射は、広範かつ強固な神経細胞の表現が得られます。ここでは、YFPまたはニワトリβアクチンプロモーター（CBAプロモーター）の制御下にtdTomatoの蛍光遺伝子を用いてウイルス形質導入を評価した。これらの構築物は、AAV8にパッケージ化および新生児（P0）ICRマウスの側脳室に注入した。高いウイルス力価（半球あたり10 10個の粒子）が嗅球、線条体、大脳?...

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Intracerebroventricular Viral Injection of the Neonatal Mouse Brain for Persistent and Widespread Neuronal Transduction

Here we demonstrate a technique for widespread neuronal transduction by intraventricular injection of adeno-associated virus into the neonatal mouse brain. This method provides a rapid and easy way to attain lifelong expression of virally-delivered transgenes.

永続かつ広範な神経伝達のための新生児マウス脳の脳室内ウイルス注射

With the pace of scientific advancement accelerating rapidly, new methods are needed for experimental neuroscience to quickly and easily manipulate gene ...

intracerebroventricular-viral-injection-neonatal-mouse-brain-for

Research

JoVE Journal

Neuroscience

59.0K ビュー.  Baylor College of Medicine. Here we demonstrate a technique for widespread neuronal transduction by intraventricular injection of adeno-associated virus into the neonatal mouse brain. This method provides a rapid and easy way to attain lifelong expression of virally-delivered transgenes.

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Ultrasound-Guided Microinjection into the Mouse Forebrain In Utero at E9.5

In utero survival surgery in mice permits the molecular manipulation of gene expression during development. However, because the uterine wall is opaque during early embryogenesis, the ability to target specific parts of the embryo for microinjection is greatly limited. Fortunately, high-frequency ultrasound imaging permits the generation of images that can be used in real time to guide a microinjection needle into the embryonic region of interest. Here we describe the use of such imaging to guide the injection of retroviral vectors into the ventricular system of the mouse forebrain at embryonic day (E) 9.5. This method uses a laparotomy to permit access to the uterine horns, and a specially designed plate that permits host embryos to be bathed in saline while they are imaged and injected. Successful surgeries often result in most or all of the injected embryos surviving to any subsequent time point of interest (embryonically or postnatally). The principles described here can be used with slight modifications to perform injections into the amnionic fluid of E8.5 embryos (thereby permitting infection along the anterior posterior extent of the neural tube, which has not yet closed), or into the ventricular system of the brain at E10.5/11.5. Furthermore, at mid-neurogenic ages (~E13.5), ultrasound imaging can be used direct injection into specific brain regions for viral infection or cell transplantation. The use of ultrasound imaging to guide in utero injections in mice is a very powerful technique that permits the molecular and cellular manipulation of mouse embryos in ways that would otherwise be exceptionally difficult if not impossible.

Ultrasound-Guided Microinjection into the Mouse Forebrain In Utero at E9.5

In utero survival surgery in mice permits the molecular manipulation of gene expression during development. Here we describe the use of high-frequency ultrasound imaging to guide the injection of retroviral vectors into the mouse brain at embryonic day (E) 9.5.

超音波ガイド下のマウスの前脳へのマイクロインジェクション子宮内で E9.5で

In utero survival surgery in mice permits the molecular manipulation of gene expression during development.  However, because the uterine wall is opaque ...

神経科学

Mosaic Analysis of Gene Function in Postnatal Mouse Brain Development by Using Virus-based Cre Recombination

Normal brain function relies not only on embryonic development when major neuronal pathways are established, but also on postnatal 
development when neural circuits are matured and refined. Misregulation at this stage may lead to neurological and psychiatric disorders such as autism 
and schizophrenia1,2. Many genes have been studied in the prenatal brain and found crucial to many developmental processes3-5. However, their 
function in the postnatal brain is largely unknown, partly because their deletion in mice often leads to lethality during neonatal development, and partly because their requirement in early development hampers the postnatal analysis. To overcome these obstacles, floxed alleles of these genes are currently being generated in mice 6. When combined with transgenic alleles that express Cre recombinase in specific cell types, conditional deletion can be achieved to study gene function in the postnatal brain. However, this method requires additional alleles and extra time (3-6 months) to generate the mice with appropriate genotypes, thereby limiting the expansion of the genetic analysis to a large scale in the mouse brain.
Here we demonstrate a complementary approach that uses virally-expressed Cre to study these floxed alleles rapidly and 
systematically in postnatal brain development. By injecting recombinant adeno-associated viruses (rAAVs)7,8 encoding Cre into the neonatal brain, 
we are able to delete the gene of interest in different regions of the brain. By controlling the viral titer and coexpressing a fluorescent 
protein marker, we can simultaneously achieve mosaic gene inactivation and sparse neuronal labeling. This method bypasses the requirement of 
many genes in early development, and allows us to study their cell autonomous function in many critical processes in postnatal brain development,
 including axonal and dendritic growth, branching, and tiling, as well as synapse formation and refinement. This method has been used successfully 
in our own lab (unpublished results) and others8,9, and can be extended to other viruses, such as lentivirus 9, as well as to the expression of 
shRNA or dominant active proteins 10. Furthermore, by combining this technique with electrophysiology as well as recently-developed optical 
imaging tools 11, this method provides a new strategy to study how genetic pathways influence neural circuit development and function in mice 
and rats.

An in vivo method to test gene function in postnatal brain is described. Recombinant AAVs expressing Cre and/or a fluorescent protein are injected into neonatal mouse brain. Mosaic gene inactivation and sparse neuronal labeling are achieved, allowing rapid analysis of gene function in processes critical to neural circuit development.

ウイルスベースのCre組換えによる出生後のマウスの脳の発達における遺伝子機能のモザイク解析

Normal brain function relies not only on embryonic development when major neuronal pathways are established, but also on postnatal 
development when ...

Use of In vivo Imaging to Monitor the Progression of Experimental Mouse Cytomegalovirus Infection in Neonates

Human Cytomegalovirus (HCMV or HHV-5) is a life-threatening pathogen in immune-compromised individuals. Upon congenital or neonatal infection, the virus can infect and replicate in the developing brain, which may induce severe neurological damage, including deafness and mental retardation. Despite the potential severity of the symptoms, the therapeutic options are limited by the unavailability of a vaccine and the absence of a specific antiviral therapy. Furthermore, a precise description of the molecular events occurring during infection of the central nervous system (CNS) is still lacking since observations mostly derive from the autopsy of infected children. Several animal models, such as rhesus macaque CMV, have been developed and provided important insights into CMV pathogenesis in the CNS. However, despite its evolutionary proximity with humans, this model was limited by the intracranial inoculation procedure used to infect the animals and consistently induce CNS infection. Furthermore, ethical considerations have promoted the development of alternative models, among which neonatal infection of newborn mice with mouse cytomegalovirus (MCMV) has recently led to significant advances. For instance, it was reported that intraperitoneal injection of MCMV to Balb/c neonates leads to infection of neurons and glial cells in specific areas of the brain. These findings suggested that experimental inoculation of mice might recapitulate the deficits induced by HCMV infection in children. Nevertheless, a dynamic analysis of MCMV infection of neonates is difficult to perform because classical methodology requires the sacrifice of a significant number of animals at different time points to analyze the viral burden and/or immune-related parameters. To circumvent this bottleneck and to enable future investigations of rare mutant animals, we applied in vivo imaging technology to perform a time-course analysis of the viral dissemination in the brain upon peripheral injection of a recombinant MCMV expressing luciferase to C57Bl/6 neonates.

Use of In vivo Imaging to Monitor the Progression of Experimental Mouse Cytomegalovirus Infection in Neonates

Human Cytomegalovirus (HCMV) infection of neonates represents an important cause of mental retardation, yet the molecular events leading to virus-induced pathogenesis are still poorly understood. To investigate the dynamics of brain infection, we adapted whole-animal in vivo imaging to perform time-course analysis of neonates infected with a luciferase-recombinant virus.

活用<em生体内で&gt;</em新生児の実験マウスサイトメガロウイルス感染の進行を監視する&gt;イメージング

Human Cytomegalovirus (HCMV or HHV-5) is a life-threatening  pathogen in immune-compromised individuals. Upon congenital or neonatal  infection, the virus ...

免疫・感染学

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for tissue formation during embryonic development and tissue homeostasis during adulthood 1. Currently, great efforts are invested towards controlling the switch of somatic stem cells from expansion to differentiation because this is thought to be fundamental for developing novel strategies for regenerative medicine 1,2. However, a major challenge in the study and use of somatic stem cell is that their expansion has been proven very difficult to control.
Here we describe a system that allows the control of neural stem/progenitor cell (altogether referred to as NSC) expansion in the mouse embryonic cortex or the adult hippocampus by manipulating the expression of the cdk4/cyclinD1 complex, a major regulator of the G1 phase of the cell cycle and somatic stem cell differentiation 3,4. Specifically, two different approaches are described by which the cdk4/cyclinD1 complex is overexpressed in NSC in vivo. By the first approach, overexpression of the cell cycle regulators is obtained by injecting plasmids encoding for cdk4/cyclinD1 in the lumen of the mouse telencephalon followed by in utero electroporation to deliver them to NSC of the lateral cortex, thus, triggering episomal expression of the transgenes 5-8. By the second approach, highly concentrated HIV-derived viruses are stereotaxically injected in the dentate gyrus of the adult mouse hippocampus, thus, triggering constitutive expression of the cell cycle regulators after integration of the viral construct in the genome of infected cells 9. Both approaches, whose basic principles were already described by other video protocols 10-14, were here optimized to i) reduce tissue damage, ii) target wide portions of very specific brain regions, iii) obtain high numbers of manipulated cells within each region, and iv) trigger high expression levels of the transgenes within each cell. Transient overexpression of the transgenes using the two approaches is obtained by different means i.e. by natural dilution of the electroporated plasmids due to cell division or tamoxifen administration in Cre-expressing NSC infected with viruses carrying cdk4/cyclinD1 flanked by loxP sites, respectively 9,15.
These methods provide a very powerful platform to acutely and tissue-specifically manipulate the expression of any gene in the mouse brain. In particular, by manipulating the expression of the cdk4/cyclinD1 complex, our system allows the temporal control of NSC expansion and their switch to differentiation, thus, ultimately increasing the number of neurons generated in the mammalian brain. Our approach may be critically important for basic research and using somatic stem cells for therapy of the mammalian central nervous system while providing a better understanding of i) stem cell contribution to tissue formation during development, ii) tissue homeostasis during adulthood, iii) the role of adult neurogenesis in cognitive functions, and perhaps, iv) better using somatic stem cells in models of neurodegenerative diseases.

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Controlling the expansion of somatic stem cells is a major factor hampering their study and use in therapy. Here we describe a system to temporally control neural stem cells expansion during development and adulthood, which can be used to increase the number of neurons generated in the mouse brain.

によって胚および成体神経幹細胞の拡大<em&gt;子宮内</em&gt;エレクトロポレーションまたはウイルス定位注射

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for ...

Intracerebroventricular and Intravascular Injection of Viral Particles and Fluorescent Microbeads into the Neonatal Brain

In the study on the pathogenesis of viral encephalitis, the infection method is critical. The first of the two main infectious routes to the brain is the hematogenous route, which involves infection of the endothelial cells and pericytes of the brain. The second is the intracerebroventricular (ICV) route. Once within the central nervous system (CNS), viruses may spread to the subarachnoid space, meninges, and choroid plexus via the cerebrospinal fluid. In experimental models, the earliest stages of CNS viral distribution are not well characterized, and it is unclear whether only certain cells are initially infected. Here, we have analyzed the distribution of cytomegalovirus (CMV) particles during the acute phase of infection, termed primary viremia, following ICV or intravascular (IV) injection into the neonatal mouse brain. In the ICV injection model, 5 &#181;l of murine CMV (MCMV) or fluorescent microbeads were injected into the lateral ventricle at the midpoint between the ear and eye using a 10-&#181;l syringe with a 27 G needle. In the IV injection model, a 1-ml syringe with a 35 G needle was used. A transilluminator was used to visualize the superficial temporal (facial) vein of the neonatal mouse. We infused 50 &#181;l of MCMV or fluorescent microbeads into the superficial temporal vein. Brains were harvested at different time points post-injection. MCMV genomes were detected using the in situ hybridization method. Fluorescent microbeads or green fluorescent protein expressing recombinant MCMV particles were observed by fluorescent microscopy. These techniques can be applied to many other pathogens to investigate the pathogenesis of encephalitis.

Here, we describe a simple method of intracerebroventricular and intravascular injection of viral particles or fluorescent microbeads into the neonatal mouse brain. The localization pattern of the virus and nanoparticles could be detected by microscopic evaluation or by in situ hybridization.

新生児の脳へのウイルス粒子と蛍光マイクロビーズの脳室内および血管内注入

In the study on the pathogenesis of viral encephalitis, the infection method is critical. The first of the two main infectious routes to the brain is the ...

Stereotaxic Surgery for Genetic Manipulation in Striatal Cells of Neonatal Mouse Brains

Many genes are expressed in embryonic brains, and some of them are continuously expressed in the brain after birth. For such persistently expressed genes, they may function to regulate the developmental process and/or physiological function in neonatal brains. To investigate neurobiological functions of specific genes in the brain, it is essential to inactivate genes in the brain. Here, we describe a simple stereotaxic method to inactivate gene expression in the striatum of transgenic mice at neonatal time windows. AAV-eGFP-Cre viruses were microinjected into the striatum of Ai14 reporter gene mice at postnatal day (P) 2 by stereotaxic brain surgery. The tdTomato reporter gene expression was detected in P14 striatum, suggesting a successful Cre-loxP mediated DNA recombination in AAV-transduced striatal cells. We further validated this technique by microinjecting AAV-eGFP-Cre viruses into P2Foxp2fl/fl mice. Double labeling of GFP and Foxp2 showed that GFP-positive cells lacked Foxp2 immunoreactivity in P9 striatum, suggesting the loss of Foxp2 protein in AAV-eGFP-Cre transduced striatal cells. Taken together, these results demonstrate an effective genetic deletion by stereotaxically microinjected AAV-eGFP-Cre viruses in specific neuronal populations in the neonatal brains of floxed transgenic mice. In conclusion, our stereotaxic technique provides an easy and simple platform for genetic manipulation in neonatal mouse brains. The technique can not only be used to delete genes in specific regions of neonatal brains, but it also can be used to inject pharmacological drugs, neuronal tracers, genetically modified optogenetics and chemogenetics proteins, neuronal activity indicators and other reagents into the striatum of neonatal mouse brains.

We describe a protocol of stereotaxic surgery with a homemade head-fixed device for microinjecting reagents into the striatum of neonatal mouse brains. This technique allows genetic manipulation in neuronal cells of specific regions of neonatal mouse brains.

新生児マウス脳の線条体細胞の遺伝的操作の定位手術

Many genes are expressed in embryonic brains, and some of them are continuously expressed in the brain after birth. For such persistently expressed genes, ...

Targeting the Corticospinal Tract in Neonatal Rats with a Double-Viral Vector using Combined Brain and Spine Surgery

Successfully tackling the obstacles that constrain research on neonatal rats is important for studying the differences in outcomes seen in pediatric spinal cord injuries (SCIs) compared to adult SCIs. In addition, reliably introducing therapies into the target cells of the central nervous system (CNS) can be challenging, and inaccuracies can compromise the efficacy of the study or therapy. This protocol combines viral vector technology with a novel surgical technique&#160;to accurately introduce gene therapies into neonatal rats at postnatal day 5. Here, a virus engineered for retrograde transport (retroAAV2) of Cre is introduced at the axon terminals of corticospinal neurons in the spinal cord, where it is subsequently transported to the cell bodies. A double-floxed&#160;inverted orientation (DIO) designer receptor exclusively activated by designer drug(s) (DREADD) virus is then injected into the somatomotor cortex of the brain. This double-infection technique promotes the expression of the DREADDs only in the co-infected corticospinal tract (CST) neurons.&#160;Thus, the simultaneous co-injection of the somatomotor cortex and cervical CST terminals is a valid method for studying the chemogenetic modulation of recovery following cervical SCI models in neonatal rats.

This protocol demonstrates a novel method for applying gene therapies to subpopulations of cells in neonatal rats at postnatal ages 5-10 days by injecting an anterograde chemogenetic modifier into the somatomotor cortex and a retrogradely transportable Cre recombinase into the cervical spinal cord.

脳と脊椎を組み合わせた手術を用いた二重ウイルスベクターによる新生児ラットの皮質脊髄路の標的化

Successfully tackling the obstacles that constrain research on neonatal rats is important for studying the differences in outcomes seen in pediatric ...

Intravenous Injections in Neonatal Mice

Intravenous injection is a clinically applicable manner to deliver therapeutics. For adult rodents and larger animals, intravenous injections are technically feasible and routine. However, some mouse models can have early onset of disease with a rapid progression that makes administration of potential therapies difficult. The temporal (or facial) vein is just anterior to the ear bud in mice and is clearly visible for the first two days after birth on either side of the head using a dissecting microscope. During this window, the temporal vein can be injected with volumes up to 50 &#956;l. The injection is safe and well tolerated by both the pups and the dams. A typical injection procedure is completed within 1-2 min, after which the pup is returned to the home cage. By the third postnatal day the vein is difficult to visualize and the injection procedure becomes technically unreliable. This technique has been used for delivery of adeno-associated virus (AAV) vectors, which in turn can provide almost body-wide, stable transgene expression for the life of the animal depending on the viral serotype chosen.

Animal models of pediatric disease can experience early onset and aggressive disease progression. Clinically relevant therapy delivery to young mouse models can be technically difficult. This protocol describes a non-invasive intravenous injection method for newborn mice within the first two postnatal days of life.

新生児マウスにおける静脈注射

Intravenous injection is a clinically applicable manner to deliver therapeutics. For adult rodents and larger animals, intravenous injections are ...

生物学

新生児マウスに髄腔内注射を実施するための包括的なプロトコル

Intrathecal Injection of Newborn Mouse for Genome Editing and Drug Delivery

Intrathecal injection is a commonly employed procedure in both pediatric and adult clinics, serving as an effective means to administer medications and treatments. By directly delivering medications and treatments into the cerebrospinal fluid of the central nervous system, this method achieves higher localized drug concentrations while reducing systemic side-effects compared to other routes such as intravenous, subcutaneous, or intramuscular injections. Its importance extends beyond clinical settings, as intrathecal injection plays a vital role in preclinical studies focused on treating neurogenetic disorders in rodents and other large animals, including non-human primates. However, despite its widespread application, intrathecal injection in young, particularly neonatal pups, poses significant technical challenges due to their small size and fragile nature. Successful and reliable administration of intrathecal injections in newborn mice requires meticulous attention to detail and careful consideration of various factors. Thus, there is a crucial need for a standardized protocol that not only provides instructions but also highlights key technical considerations and good laboratory practices to ensure procedural consistency, as well as the safety and welfare of the animals.
To address this unmet need, we present a detailed and comprehensive protocol for performing intrathecal injections specifically in newborn pups on postnatal day 1 (P1). By following the step-by-step instructions, researchers can confidently perform intrathecal injections in neonatal pups, enabling the accurate delivery of drugs, antisense oligos, and viruses for gene replacement or genome editing-based treatments. Furthermore, the importance of adhering to good laboratory practices is emphasized to maintain the well-being of animals and ensure reliable experimental outcomes. This protocol aims to address the technical challenges associated with intrathecal injections in neonatal mice, ultimately facilitating advances in the field of neurogenetic research that aims to develop potential therapeutic interventions.

著者スポットライト:髄腔内注射 – 新生児マウスの脳における遺伝子編集の有効性をテストするための効率的で信頼性の高い送達方法

The present protocol outlines step-by-step instructions for performing intrathecal injections in neonatal mice for gene editing and drug delivery.

ゲノム編集とドラッグデリバリーのための新生児マウスの髄腔内注射

Intrathecal injection is a commonly employed procedure in both pediatric and adult clinics, serving as an effective means to administer medications and ...

永続かつ広範な神経伝達のための新生児マウス脳の脳室内ウイルス注射

要約

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超音波ガイド下のマウスの前脳へのマイクロインジェクション子宮内で E9.5で

ウイルスベースのCre組換えによる出生後のマウスの脳の発達における遺伝子機能のモザイク解析

活用

によって胚および成体神経幹細胞の拡大

新生児の脳へのウイルス粒子と蛍光マイクロビーズの脳室内および血管内注入

新生児マウス脳の線条体細胞の遺伝的操作の定位手術

脳と脊椎を組み合わせた手術を用いた二重ウイルスベクターによる新生児ラットの皮質脊髄路の標的化

新生児マウスにおける静脈注射

ゲノム編集とドラッグデリバリーのための新生児マウスの髄腔内注射

ゲノム編集とドラッグデリバリーのための新生児マウスの髄腔内注射