我々は、リガンド結合部位、サブユニット配向、リガンド結合に関連する立体構造変化、およびタンパク質の動的運動の同定および特性評価を可能にするFRETマッピング方法論を開発しました。この技術の利点は、溶液中で行うことができ、分子が自由に動き回ることができることである。この技術によって測定される距離は、生物学的システムに適しています。
FRETは、多くのシステムに広く適用できます。マッピングは、あらゆる生体分子系における構造的および動的変化のモニタリングを強化し、3次元構造情報が存在する場合に特に有効である。タンパク質を精製した後、最も難しい部分は、高効率で標識し、遊離色素を除去することです。
実験のために、それはできるだけ少ない自由な染料を持つのを助けます。開始するには、懲罰的結合部位の25〜75オングストローム以内、およびタンパク質の比較的静的な領域における標識部位を選択する。距離は、使用する特定のFRET色素対を決定する。
互いに比較的異なるタンパク質領域内の標識部位を見つけます。したがって、サイトは三角形の頂点を記述し、懲罰的な結合部位は中央に位置しています。R0値を測定するために、所望のキュベットサイズおよび体積に応じて、全タンパク質の同じ濃度で2つのタンパク質サンプルを調製する。
1つはドナー色素のみで標識されたタンパク質で、もう1つはアクセプター色素のみで標識されたタンパク質です。分光蛍光光度計を使用している場合は、蛍光光度計をオンにし、FluorEssenceソフトウェアでスペクトル取得および分析プログラムを開きます。赤いMをクリックしてコンピュータを装置に接続し、発光スペクトルを選択します。
[実験の収集] メニュー項目を使用して、励起波長、発光スキャンの範囲、温度、サンプルの位置の変更など、スキャン パラメーターを入力します。原稿に記載されているようにRTCと最適化された機器設定をクリックし、色素の吸収最大に設定された励起波長を使用してピーク時の蛍光発光を監視します。ドナー標識タンパク質サンプルをサンプルホルダーに入れ、実行をクリックしてドナー色素のみで標識されたタンパク質の発光スキャンを生成し、色素吸収最大でサンプルを励起し、発光ピークをスキャンする。
ピークの終わりを過ぎて 25 ~ 50 ナノメートルでスキャンを延長して、スキャンのベースラインを確立します。テキスト原稿に記載されているように、異なる濃度のサンプルに対して吸収および蛍光測定を行うことにより、ドナーのみのタンパク質の量子収率を測定する。ドナーのみのタンパク質、アクセプターのみのタンパク質、およびドナー-アクセプタータンパク質のサンプルを同じ濃度で調製します。
ドナーのみのスキャンを取得し、蛍光発光スペクトルを生成する。ドナー色素吸収極大で溶液を励起し、ドナーおよびアクセプター発光ピークをスキャンする。サンプルをアクセプターのみのタンパク質に交換するか、またはサンプルを変更してアクセプターのみのタンパク質を含むキュベットに位置を変更します。
アクセプター色素のみで標識されたタンパク質の発光スキャンを取得します。ドナー励起波長で試料を励起する。サンプルをドナーアクセプタータンパク質サンプルに交換するか、サンプルを変更して、ドナーアクセプター標識タンパク質を含むキュベットに位置を変更します。
同じ設定を使用してドナー - アクセプタータンパク質サンプルの発光スキャンを取得します。すべてのスペクトルについて、スキャンの終了時に測定されたバックグラウンドカウントを差し引いてバックグラウンド蛍光を補正します。PyMOLなどの3Dグラフィカル表示プログラムを使用して、スクリプトからコマンドウィンドウに適切な距離情報を直接入力することにより、距離を構造にマッピングします。
測定された距離ごとにシェルを生成し、関連する誤差を生成します。異なるシェルの交点を通る位置をマップします。シグナルペプチド結合部位を、SecAおよびSecEG上の3つの異なる位置、およびシグナルペプチド上の4つの異なる位置を用いてマッピングした。
前タンパク質の異なる領域と、SecAおよびSecYEGタンパク質上の3つの異なる位置との間のFRET実験は、前タンパク質結合部位および配向をマッピングする。シグナルペプチドの懲罰的結合部位は、以前に2らせんフィンガーとして同定されており、SecA C末端尾部は、2ヘリックスフィンガーに平行な配向を示唆していた。SecA37と、PhoA2と、PhoA22との間の定常状態FRETスペクトルが得られた。
ドナー強度の低下は、PhoA22から伝達されるエネルギーが大きいことを示した。SecA37から遠く離れた場所にあるPhoA2サイトに対して。時間分解蛍光減衰スペクトルは、ドナー-アクセプター複合体が、1つの距離に関連するエネルギー移動と一致するより短い均質な減衰を有することを実証した。
SecA PhoA2残基と三角測量部位との間に構築されたFRET距離シェルは、各シェルが緑色で示されている仮定された結合部位である2らせんフィンガーと交差することを実証した。交差する領域は、各FRETシェルよりも小さく、ヘリカル足場からの大きな寄与を含む。PhoA2残基と標識部位との間に決定されたシェルのFRET距離は、SecYEGチャネルの2らせん指および口の先端に近い位置に位置するより小さな領域を記述する。
この交差領域は、PhoA2からの2らせん指の反対側の端に位置する。考慮すべき重要なことは、関心領域を三角測量し、各部位の量子収率を測定し、すべての遊離色素を除去するための標識部位の適切な選択を含む。この方法は、NMRやX線結晶構造解析などの方法で得られた構造情報と一致します。
FRETの結果を構造的なコンテキストに入れると、既存の情報を強化できます。
