蛍光ベースの膜電位アッセイは、上皮細胞で内因的に発現するイオンチャネルに対するモジュレーターの効果を研究するための堅牢な方法を提供します。概念実証として、よく知られている上皮細胞株における2つのイオンチャネルの機能を測定しています。このアッセイは、外因性の化学プローブを使用してイオンチャネル機能を測定するため、汎用性が高く、遺伝的にコードされたプローブの必要性を回避します。
これらのハイスループットアッセイは、嚢胞性線維症の治療を進歩させる可能性のあるイオンチャネルに対する低分子モジュレーターの効果を同定し、特徴付けることができます。まず、EMEMを含むT75フラスコでCalu-3およびCaco-2細胞を、20%ウシ胎児血清および1%ペニシリンストレプトマイシンとともに培養します。細胞が80〜100%コンフルエントに達した後、T75フラスコから培地を吸引します。
細胞を10ミリリットルのリン酸緩衝生理食塩水で穏やかに洗浄します。次に、2ミリリットルの予熱した0.25%トリプシンを0.1%EDTAとともに細胞単層に加えます。フラスコを摂氏37度で約5分間置きます。
このステップでは、細胞がフラスコ表面から浮き上がり、単一細胞懸濁液に解離することを確認します。8ミリリットルの培養液を加えて反応を中和する。細胞が30〜40%コンフルエントに達したら、1.5ミリリットルの細胞懸濁液をコニカルチューブ内の18.5ミリリットルの培養培地に加え、混合します。
この細胞懸濁液を200マイクロリットルを96ウェルプレートの各ウェルに加え、ウェルあたり約140, 000細胞を得る。1枚のフル384ウェルプレートをプレートするには、1ミリリットルの細胞懸濁液をコニカルチューブ内の17ミリリットルの培養培地に加えて、ウェルあたり約50, 000個の細胞を得る。混合後、50マイクロリットルの細胞懸濁液を各ウェルに加える。
2日ごとに培地を交換し、すべてのウェルで同時に細胞が3〜5日以内に100%コンフルエントに達するようにします。機能研究の24時間前に培地を交換してください。まず、テキストプロトコルに記載されている試薬を使用して、ナトリウムフリー、塩化物フリーの緩衝液を調製します。
試薬を組織培養グレードの二重蒸留水に加えます。室温で一晩攪拌して試薬を溶解させます。溶液が安定したら、1モルのNMDG溶液を滴下してpHを7.4に調整します。
30分間混合し、溶液の浸透圧をキログラムあたり300プラスマイナス5ミリモルの範囲に調整します。緩衝液をろ過し、滅菌ボトルに保管します。次に、0.5ミリグラムの膜電位色素を1ミリリットルのナトリウムフリー、塩化物フリーのバッファーに溶解し、溶液を摂氏37度に温めます。
Calu-3およびCaco-2細胞単層から培地を除去します。96ウェルプレートの場合はウェルあたり195マイクロリットル、384ウェルプレートの場合はウェルあたり95マイクロリットルの色素溶液を追加します。細胞が摂氏37度と5%二酸化炭素で35分間色素をロードできるようにします。
次に、530ナノメートルで励起し、560ナノメートルで発光して蛍光測定を行います。最初に、30秒間隔で5分間連続したベースライン読み取りを行います。次いで、5マイクロリットルの400マイクロモルのフォルスコリン溶液を96ウェルプレートの各ウェルに添加し、1マイクロモルの最終フォルスコリン濃度を得た。
384ウェルプレートの場合、5マイクロリットルの20マイクロモルフォルスコリン溶液を追加します。15秒間隔で測定して20分間刺激評価を行います。次に、CFTR阻害剤の400マイクロモル溶液を5マイクロリットルを96ウェルプレートに加え、終濃度10マイクロモルを得た。
384ウェルプレートに、5マイクロリットルの200マイクロモルCFTR阻害剤を添加する。30秒間隔で測定しながら、15分間抑制測定値を取得します。各ウェルの蛍光強度測定値を定量化し、値をスプレッドシートとしてエクスポートします。
個々のウェルを含むカラム形式で。フォルスコリン誘発性変化を計算するには、96ウェルプレートの各ウェルからの相対蛍光単位測定値をベースライン測定値の最後の蛍光強度測定値で割り、それらをプロットします。フォルスコリン刺激中にベースラインから測定された最大蛍光強度としてピーク応答を測定します。
この測定値または曲線下面積を使用して、CFTR応答を定量化します。CFTR機能は、Caco-2細胞におけるフォルスコリン刺激後の膜脱分極として検出された。フッ化物流出は、ビヒクル対照としてのDMSOと比較して蛍光の急激な増加として検出された。
フォルスコリン刺激後、蛍光シグナルはCFTR阻害剤を添加するまで持続し、その後蛍光強度が急速に低下した。この現象は、Caco-2細胞とCalu-3細胞の両方で再現可能でした。CFTR活性は、フォルスコリンまたはDMSO刺激後の蛍光の最大変化の差として計算した。
個々のポイントは、フォルスコリン刺激およびDMSOコントロールの場合の平均からプラスマイナス3標準偏差の範囲であり、アッセイの再現性を示しています。機能応答の特異性を確認するために、これらの膜電位アッセイは、Ussingチャンバーなどの従来の電気生理学的方法を使用してさらに検証できます。このプラットフォームは、ハイスループットモジュレータースクリーンと異種発現システムとの間のギャップ、およびアクセスが困難な一次組織における時間のかかる生体電気測定を埋めることができます。
