配向した繊維からなる三重構造は、人体のいたるところに見られます。この方法を適用すると、自然条件を模倣した心臓弁小葉だけでなく、他のさまざまな組織も作成できます。導電性材料から3Dプリントされたコレクターがエレクトロスピニングに使用されたのはこれが初めてであり、このプロセスを非常に柔軟で費用対効果の高いものにしています。
まず、STLファイル試料マウントAと試料マウントBをスライスソフトウェアにアップロードして、3Dプリントを開始します。モデルを回転させて、三角形のサーフェスがビルドプレートに配置されるようにします。すべての部品にマークを付け、右クリックして選択し、選択したモデルを乗算します。
プロンプトのコピー数に 1 つを入力し、「OK」をクリックします。スライスの厚さを0.1ミリメートル、壁の厚さを1ミリメートル、インフィル密度を40%に設定し、サポートボックスの生成のチェックを外します。スライスボタンをクリックし、[リムーバブルに保存]を選択して印刷ファイルをUSBドライブに保存します。設定を保持し、STL ファイルをスライスソフトウェアのコレクターフランジとリーフレットテンプレートに置き換えます。
コピーツールを使用して、印刷を開始する前に、フランジのコピーを 1 部、テンプレートを 8 部作成します。印刷が完了したら、ビルド プレートからモデルを取り出します。リーフレットネガティブの底部にある個々のフィラメント繊維がリーフレットモデルに存在する場合は、ワイヤーカッターで慎重に取り除きます。
紡糸溶液を調製するには、排気フードの下にスケールを置きます。その上に200ミリリットルのスクリューキャップガラス瓶を置き、スケールを風袋に入れます。50ミリリットルのジメチルホルムアミドと50ミリリットルのテトラヒドロフランをガラス瓶に注ぐ。
なお、溶媒の重量。ボトルの中に磁気バーを置きます。ボトルをマグネチックスターの上に置き、スイッチを入れます。
室温で攪拌しながら溶媒混合物を入れたガラス瓶に相当量のポリウレタンをゆっくりと移し、均一な溶液を得た。その後、蓋を閉めます。3D プリントされた部品を金属製の棒と一緒に組み立ててコレクターを作成し、すべてのテンプレートの向きが正しいことを確認します。
組み立てたコレクタをエレクトロスピニングセットアップに配置し、フランジをモータ軸にしっかりと固定します。ワニクリップを使用して、カソードに接続されているケーブルを14ゲージの針に接続し、クリップと針の接続を確認します。クロコダイルクリップと2本目の高圧ケーブルを使用してコレクタをアノードに接続します。
スリップリングまたは剥がしたケーブルを使用して、コレクターのフランジに接触を作成します。ルアーロックシリンジに20ミリリットルの紡糸溶液を充填して準備する。シリンジを耐溶剤性チューブに接続し、針の先端に液滴が見えるまで溶液を手動でチューブシステムに押し込みます。
シリンジをシリンジポンプに入れます。ポンプの電源を入れた後、直径を19.129ミリメートル、体積を5ミリリットル、速度を毎時3ミリリットルに設定します。モーターをテスト実行するには、接続ボタンをクリックしてモーター制御に接続します。
接続後、プロファイル速度操作モードを選択し、画面の左上隅にある操作タブをクリックします。赤い線で囲まれたクイックストップボタンの下にあるプロファイル速度タブを選択します。次に、目標速度を200RPMに設定し、プロファイル加速度を100、プロファイル減速を200、クイックストップを5,000に設定します。
テスト実行を開始し、コレクタにアンバランスがないか確認します。スイッチオン有効ボタンをクリックしてモーターを停止し、目標速度を2, 000 RPMに変更します。モータ制御ソフトウェアでレイヤを製造するには、[有効にする]操作ボタンをクリックしてモータの電源を入れます。
高電圧電源の電源を入れ、マイナス極を18キロボルト、プラス極を1.5キロボルトにしてアノードとカソードの両方の電圧を調整します。シリンジポンプを1時間あたり3ミリリットルの流量で始動する。テイラーコーンの形成のために針先を観察し、針先のコーンの形状に応じて、安定したテイラーコーンが確立されるまでカソードでの電圧を100ボルト刻みで調整する。
電源ユニット、シリンジポンプ、モーターをオフにして、紡績プロセスを停止します。次に、モータ制御ソフトウェアで目標速度を10 RPMに変更し、前述のように層の製造プロセスをさらに20分間繰り返します。2番目の層を追加した後、コレクタフランジをモータ軸に接続するネジを慎重に開き、電界紡糸装置からリーフレットコレクタを取り外します。
メスを使用して、各リーフレットテンプレートの外側の輪郭に沿ってエレクトロスピニングされた繊維を切断する。コレクターの片側にあるフランジを取り外します。次に、3Dプリントされたインサートを引き出し、リーフレットテンプレートを非導電性の三角形ホルダーから分離します。
すべてのリーフレットテンプレートを 90 度回転させ、コレクターを組み立て直します。コレクタをエレクトロスピニングセットアップに挿入し、しっかりと固定します。ここでも、モータ制御ソフトウェアで目標速度を 2, 000 RPM に戻し、前述のように層の製造プロセスを 20 分間開始して、繊維の 3 番目の層を追加します。
電界紡糸装置から集電体を取り外した後、試料を摂氏40度の加熱キャビネットで乾燥させる。サンプルが完全に乾燥したら、メスを使用してリーフレットテンプレートの端に沿って慎重に切断し、余分な繊維を除去します。その後、テンプレートのリーフレット足場を慎重に剥がし、さらに使用するためにトレイの上に置きます。
三重層の小葉足場は、ネイティブのヒト心臓弁のコラーゲン構成を模倣し、各層は直径約4.1マイクロメートルの繊維からなる。走査型電子顕微鏡イメージングにより、平滑な表面と円周方向の厳密な配向を有する配向繊維が、配向していない繊維は配向が乱れ、繊維間の多くの顕著な交点を示した。蛍光イメージングにより、最下層は水平配向に整列した繊維で構成され、繊維間の交点がほとんどないことが明らかになりました。
中間層は一次繊維配向のない非配向繊維を示し、最上層は垂直配向で配向繊維を示す。厚さ測定は、毎分約2.65マイクロメートルの厚さの線形増加を示す。60分後、毎分約2.52マイクロメートルの厚さの増加が観察された。
整列した繊維足場の引張試験では、円周方向と垂直方向に沿ってミリメートル平方あたり約 12 および 3 ニュートンの強度が得られます。しかしながら、非配向繊維足場は、異なる配向に対して引張強度に差を示さない。整列繊維足場は、円周方向および垂直方向に約187%および107%の伸展性を示し、一方、非配向繊維は、両方向に均一な伸展性を示した。
応力ひずみ曲線は、非配向繊維マットが線形弾性挙動を示すことを示し、一方、配向繊維は軸方向の非線形性を明らかにした。作成されたリーフレットは、生物学的および生体力学的評価に使用することができる。そのうちの3つを組み立てて機能的な大動脈弁を作成すると、幅広いin vitro実験を行うことができます。
このプロトコルにより、仲間の研究者は多層繊維足場を製造するだけでなく、繊維を配向させることもできます。したがって、彼らは多くの異なるタイプの組織を模倣することができるでしょう。
