私たちの方法は、水サンプル中の抗生物質耐性菌の全体的な負荷など、重要な質問に答えます。これらの細菌の正体は何ですか、そしてそれらが運んでいる抗生物質耐性形質と遺伝子の異なるタイプは何ですか?私たちのプロトコルの利点は、水サンプル中の全細菌のかなりの割合を占めるラボで増殖できない細菌でも検出できることです。
したがって、理論的には、細菌またはその耐性形質は除外されません。培養ベースと培養に依存しない技術の両方を含むこの組み合わせ技術は、下水、製薬または病院の排水、臨床および非臨床環境などから得られたあらゆるサンプルに対して複製およびカスタマイズできます。デビカとともに、実験手順を実演するのは、私の研究室の上級研究員であるハルシャリ・シンデとマイトリ・ミシュラです。
まず、水サンプルを滅菌モスリン布でろ過して無菌的に処理し、粒子状物質を除去します。次に、ろ過水サンプルを順次希釈して、さらに分析します。総細菌負荷量を決定するには、ろ過水サンプルの適切な希釈液100マイクロリットルを固化したR2A寒天プレートと複製物に置き、均等に広げます。
すべてのサンプルスプレッドプレートを摂氏35〜37度で48時間インキュベートします。インキュベーション期間の後、コロニーを数え、ミリリットルあたりのコロニー形成単位で総細菌負荷を表します。抗生物質耐性菌数を決定するには、摂氏約40度で修飾された20ミリリットルの滅菌溶融R2A寒天を含むチューブに抗生物質を別々に追加します。
渦巻いて均一に混合し、寒天が固まる前に滅菌ペトリプレートに注ぎます。品質管理と抗生物質の有効性を確認するために、R2A寒天修飾プレートを含むそれぞれの抗生物質に100マイクロリットルの細菌懸濁液を広げます。プレートを摂氏35〜37度で48時間インキュベートし、細菌数を決定します。
PCR用の単離株からDNAテンプレートを調製するには、滅菌爪楊枝を使用して、ペトリプレート上で増殖する単離物の単離された純粋なコロニーを1つ採取します。細菌コロニーをマイクロ遠心チューブ内の滅菌二重蒸留水100マイクロリットルに懸濁し、沸騰水浴または乾浴中で摂氏100度で10分間煮沸する。懸濁液を10, 000 gで2分間遠心分離して破片をペレット化し、上清を新鮮な滅菌マイクロ遠心チューブに移して粗DNAテンプレートとして使用します。
PCRにより16S rRNA遺伝子のV3領域を増幅するために、PCRチューブ中で40マイクロリットルの反応混合物を調製する。チューブをサーマルブロックに入れ、PCRサーマルサイクラーで適切なプログラムを実行します。PCRアンプリコンを分離および視覚化するには、10マイクロリットルの増幅PCR産物を2マイクロリットルの6xゲルローディングバッファーに混合し、この混合物を1.5%アガロースゲルのウェルにロードし、100塩基対DNAラダーを使用してアンプリコンのサイズを推定します。
追跡色素がゲルの3/4になるまで、TAEタンクバッファー内のゲルを80〜100ボルトで電気泳動します。次に、UVトランスイルミネーターの下でアンプリコンバンドを視覚化します。接種材料を調製するには、抗生物質を含まない2ミリリットルのLuria-Bertani(LB)ブロスに滅菌ループを使用して、単一の単離された精製抗生物質耐性コロニーを無菌的に接種し、摂氏37度、80 rpmで一晩インキュベートします。
翌日、100〜150マイクロリットルの一晩培養物を2ミリリットルの新鮮な非選択的LBブロスに加え、600ナノメートルでの光学密度が0.4〜0.5に達するまで2〜4時間インキュベートします。滅菌0.85%生理食塩水を使用して新たに成長した培養懸濁液を希釈し、穏やかに混合して細胞を均等に分散させ、0.5マクファーランド標準に相当する培養密度に到達します。希釈から15分以内に、滅菌綿棒を接種材料に浸し、プレートの過剰接種を避けるために余分な懸濁液を取り除きます。
次に、準備したミューラーヒントン寒天プレートに、上から始めて端から端まで行ったり来たりして、培養物を均等に広げます。次に、プレートを60度回転させ、拭き取りを再開します。抗生物質ディスクを配置するには、火炎滅菌された鉗子を使用し、抗生物質ディスクを接種した寒天プレートに無菌的に移します。
ディスクを軽く押して、寒天との完全なレベルの接触を確保します。阻害ゾーンが重ならないように、使用する抗生物質とプレートサイズを考慮して、適切な数の抗生物質ディスクを寒天プレートに配置します。抗生物質ディスク塗布から15分以内に、プレートを反転させ、摂氏37度で一晩インキュベートします。
翌日、阻害ゾーンの直径をミリメートル単位で測定し、EUCASTによって与えられたブレークポイント値に従って解釈します。水サンプル中の総細菌負荷は3.0 x 10〜9番目のCFU / mLであり、抗生物質耐性細菌負荷は高いことがわかりました。配列決定された抗生物質耐性培養分離株は、腸内細菌科に属し、ほとんどが大腸菌と肺炎桿菌でした。
さらに、まれな日和見細菌も同定された。ディスク拡散法による抗生物質感受性試験では、8つの分離株で約0.2の複数の抗生物質耐性指数が示され、高い耐性が示されました。しかし、コマモナスとアルスロバクター種は、テストされた抗生物質のいずれに対しても耐性を示さなかった。
培養可能な分離株は、ベータラクタム、トリメトプリム、およびアミノグリコシドに対する因子をコードする抗生物質耐性遺伝子の存在を明らかにしました。全細菌多様性のメタゲノムDNA分析により、50門が同定され、アルファプロテオバクテリア、ベータプロテオバクテリア、ガンマプロテオバクテリアのクラスからなるプロテオバクテリアが最も支配的な門である高い細菌多様性を示しました。注文レベルでは、バークホルデリアレスが最も一般的であり、ベータプロテオバクテリアクラスに属していました。
一般的なレベルでは、シュードモナス、アシネトバクター、ペドバクター、プロステコバクター、リムノハビタン、フラボバクテリウム、およびコマモナスが豊富な細菌の一部でした。メタゲノムDNA分析はまた、より多くの抗生物質耐性遺伝子を明らかにしました。この方法では、エラーがあると総CFUと抗生物質耐性細菌負荷の誤った解釈につながる可能性があるため、段階希釈ステップが重要です。
また、阻害ゾーンの直径を注意深く測定して、分離株が耐性か感度かを正しく解釈する必要があります。これらのプロトコルを使用して、水サンプルに加えて、環境、食品、臨床などの他のサンプルを研究することができます。さらに、細菌以外にも、あらゆる生態系の他の微生物集団も同様のアプローチを使用して研究することができます。
