このプロトコルは、核および細胞質における定義された生化学的要素のさまざまな役割を評価し、さまざまな細胞株内のこれらのドメイン間の細胞内相互作用を分析するために必要です。この技術は、一般的なラボ機器と試薬を利用して、細胞質画分と核画分をより効率的に分離します。このプロトコルは、他のプロトコルよりも安価かつ迅速に行うことができます。
細胞質および核相互作用に関する研究が広まるにつれて、細胞内事象に対する局在の影響をよりよく理解できるようになります。核タンパク質に関する研究が示しているように、細胞質と核との間の交換を分析することができ、これらの交換中の特定の分子が癌の発生につながる可能性があるかどうかを示す。プロトコルの最も重要なステップは、溶解バッファーの濃度を適切な濃度に変更することです。
溶解バッファーの使用は細胞膜の破壊に大きく依存するため、異なる細胞株での溶解バッファーの有効性には自然な変異があります。まず、1.5ミリリットルのチューブを使用して、2000 Gで5分間遠心分離して細胞をペレット化し、吸引ピペットを使用して上清を廃棄します。ペレットを300マイクロリットルの氷冷溶解バッファーに再懸濁します。
次に、チューブを摂氏4度で約12, 000 Gの速度で2分間回転させます。上清を慎重に取り除き、新しい1.5ミリリットルのチューブに入れます。残りのペレットは核画分になります。
次に、500マイクロリットルの氷冷PBSをペレットに加え、室温で5分間2000Gで遠心分離します。qPCRを用いてコンパートメントの分離を確認するには、まず、市販のキットを用いてRNAを相補的DNAに変換する。逆転写酵素マスターミックスを調製する。
テンプレートRNAを追加します。サーモサイクラーで反応をインキュベートします。定量ポリメラーゼ連鎖反応および分析を行うために進める。
まず、cDNA合成をDEPC水で希釈して、最終濃度をミリリットルあたり20ナノグラムにします。PCRマスターミックスを使用して、手動の指示を使用して各サンプルの反応を準備します。細胞質および核分画の検出に必要な市販のプローブを入手します。
核マーカーとしてMALAT1を使用し、細胞質マーカーとしてTUG1を使用します。個々のサンプルのテクニカル反復ごとに各成分に3を掛けて、各成分の体積を計算します。各核および細胞質サンプルについて、核画分とMALAT1、細胞質画分とMALAT1、核画分とTUG1、および細胞質画分とTUG1をミックスして取得します。
溶液を短時間ボルテックスして混合し、20マイクロリットルの混合物を光学反応プレートの各ウェルに移す。qPCRに使用される透明な接着フィルムでプレートを覆い、プレートを短時間遠心分離して気泡を除去した後、サンプルを300倍Gで室温で5分間回転させます。設計および解析ソフトウェアを使用して、サイクルパラメータの検量線を選択します。
qPCRソフトウェアを使用して、セットアップ実行を選択します。データ ファイルのプロパティ ページで、メソッドと入力サイクルのパラメーターを選択します。サイクルパラメータを入力したら、プレートタブを選択し、実行するサンプルを入力します。
[実行の開始] を選択します。実行が完了したら、サンプル名、ターゲット名、定量化サイクルを含むデータスプレッドシートを作成します。MALAT1サンプルから始めて、核分率を計算します。
MALAT1核画分からMALAT1細胞質画分を差し引く。MALAT1サンプルを続行して、細胞質画分を計算します。MALAT1細胞質画分からMALAT1核画分を差し引き、次に負のデルタCQに上昇した2つを計算します。TUG1サンプルで計算を実行します。
TUG1が細胞質要素のポジティブコントロールとして存在する場合、細胞質分画レベルは核分画レベルよりも高いと予想されます。MALAT1を含むサンプルで細胞質分画のレベルが観察される否定的な結果。これは、核画分から単離されたRNAの汚染を示しており、溶解濃度が低すぎたり高すぎたりすることが原因である可能性があります。
MALAT1とTUG1は、ウェスタンブロットとRNA電気泳動によって確認されたように、核および細胞質分離と最も高い相関を示し、サンプルの純度と品質を確認しました。さらに、核および細胞質抽出物の純度は、核画分のマーカーとしてラミンを使用し、細胞質画分の陽性マーカーとしてα-チューブリンを使用するウェスタンブロットによって実証できます。細胞質RNA電気泳動ではピークは観察されず、高品質で細胞質RNAサンプルの汚染がほとんどまたはまったくないことを示しています。
溶解バッファーの使用は、適切な分画に不可欠であり、目的の細胞株に合わせて溶解バッファー濃度を最適化することが不可欠です。この技術は、核と細胞質相互作用の標的研究を可能にし、さまざまな研究トピックに広く適用可能であり、特定の生物学的要素の局在がそれらの機能とどのように相関しているかをよりよく理解することを可能にします。
