ヒト大腸癌細胞におけるDNA損傷および修復病巣の免疫蛍光イメージング

このプロトコルは、中性子混合ビームを照射した後、ヒト大腸癌細胞株における免疫蛍光染色による修復タンパク質の放射線誘発病巣を検出するためのステップバイステップの手順を提供する。免疫蛍光イメージングは、敏感な方法であり、イオン化放射線などのDNA有害物質に応答して、病巣中の修復経路タンパク質の出現の視覚的証拠を提供します。中性子混合ビームは、BNCTのホウ素中性子捕捉療法に使用され、放射線によるDNA損傷応答は完全には確立されていません。

私たちのプロトコルは、陽子線療法やハドロン療法を使用した炭素イオンのような他の高LETビームによる放射線による細胞レベルでの生物学的効果の分析にも有用であり得る。照射後、取り付けた細胞から培地を取り出し、2.5ミリリットルのPBSで1回洗浄します。その後、1ミリリットルの70%エタノールで細胞を10分間固定します。

細胞を透過させるには、エタノールを取り除き、2.5ミリリットルのPBSで洗浄する。PBSに2%トリトンX-100の1ミリリットルをそっと加えてカバーリップを覆い、室温で5分間細胞をインキュベートします。細胞をPBSで3回洗浄し、PBSで希釈した2%BSAの1ミリリットルでパーメアビライズをブロックします。

その後、2%BSAで最低30分間細胞をインキュベートします。細胞を染色するには、テキスト原稿で推奨されるように、BSAでPBSで希釈された一次抗体の適切な量を追加します。その後、ペトリ皿を覆い、湿度を維持するために保湿リグニンとプラスチックボックスに置きます。

摂氏37度で30分間インキュベートします。インキュベーション後、PBSで3回のスミッシュを行い、適切な量の二次抗体を加える。保湿リグニンでプラスチックボックスに皿を戻し、37°Cで少なくとも30分間インキュベートします。

次にPBSでの化すれを繰り返し、1ミリリットル当たり1マイクログラムの最終濃度に希釈したDAPIの100マイクロリットルを加えて核に対抗する。細胞を室温で最大2分間インキュベートし、PBSで洗い洗いを繰り返します。最後の洗浄後、PBSを取り出し、気泡の形成を避け、取り付け媒体の上にカバースリップをそっと置きます。

カバースリップの端をマニキュアで密封し、蛍光顕微鏡を行う前に取り付け媒体を硬化させます。DNA二本鎖破断の標準的なマーカーであるγ-H2AX病巣は、中性子混合、ビーム照射、および非照射結腸癌細胞で検出された。病巣は、明確な蛍光点として表示されます。

照射された細胞においてガンマH2AX病巣のより高い直径が観察された。さらに、高LETアルファ粒子の単一のトラックが核を横切って検出された。免疫蛍光顕微鏡を用いて、代表的な修復タンパク質Rad52およびDNA依存性プロテインキナーゼを検出した。

DNA依存性プロテインキナーゼ病巣径の高い平均値を、コントロール細胞と比較して照射後のDNA破断で測定した。クラスター化されたDNA二本鎖の切断は、より複雑で大きく、より高い強度を有するクラスター化された病巣として照射された細胞で観察された。免疫蛍光染色の最も重要な段階は、細胞の固定と細胞膜の透過性です。

これらのステップは、抗体がそれらの細胞と細胞内修復タンパク質の両方に容易に浸透できるようにするために必要とされる。この手順は、細胞レベルでの各修復経路の活性化に関する情報を提供します。その結果は、リアルタイムPCRなどのアッセイを用いて分子レベルで確認する必要があります。

この技術により、抗がん剤を用いたビームの異なる場合には十分に決定されていない放射線によるDNA損傷応答を探索することが可能になります。