ハイスループットスクリーニングカルシウム蛍光二重付加アッセイは、細胞内カルシウムカスケードを介してシグナル伝達するGタンパク質共役型受容体の新規低分子リガンドの同定を可能にします。二重付加アッセイの主な利点は、蛍光シグナルが2分間続く同じ細胞を用いた単一のアッセイでアゴニストおよびアンタゴニストHTSを検出できることである。この方法は、カルシウムカスケードを介してシグナルを伝達する任意のGPCRに適用することができ、これは、ほとんどの節足動物ニューロンペプチドファミリーである、GPCRsを含む。
アッセイの再現性のためには、第2版の既知のアゴニストの細胞密度、注入速度、および濃度を最適化することが重要です。手順を実演するのは、私の研究室のポスドク研究員であるビアンカ・エンリケス・サントスです。カルシウム蛍光アッセイは、70〜90%コンフルエントなBMLK3細胞を含むT−75フラスコから使用済み培地を除去することによって開始する。
10ミリリットルのダルベッコリン酸緩衝生理食塩水またはDPBSで細胞を洗浄します。DPBSを除去した後、2ミリリットルの0.25%トリプシンエチレンジアミン四酢酸またはEDTAを使用して細胞を剥離し、摂氏37度で3〜5分間インキュベートします。8ミリリットルの選択培地を加え、細胞懸濁液を15ミリリットルの円錐管に移します。
細胞懸濁液を1000 x gで3分間遠心分離する前に。上清を廃棄し、1%ウシ胎児血清またはFBSおよび1ミリリットルあたり400マイクログラムのG418硫酸塩を含む10ミリリットルのF-12K培地に細胞ペレットを再懸濁します。さらに希釈するために懸濁液の細胞密度を決定するには、20マイクロリットルの細胞懸濁液を20マイクロリットルの0.4%トリパンブルーに混合し、次に20マイクロリットルの混合物を細胞計数チャンバーにロードして、細胞密度についてセルカウンターで読み取る。
同じF-12K培地を使用して細胞懸濁液を希釈し、ミリリットルあたり10〜5番目の細胞の4倍の密度で最終容量を15ミリリットルに構成します。細胞をPoly−DリジンまたはPDLコード化された384ウェルプレートに播種する。液体処理システムを使用して、25マイクロリットルの希釈細胞懸濁液をプレートの384ウェルに加えます。
プレートを摂氏37度で一晩インキュベートし、加湿インキュベーター内で5%二酸化炭素をインキュベートします。翌日、90%コンフルエントな384ウェルプレートをすばやく反転させます。使用済み培地を除去し、滅菌ペーパータオル上で2〜3回穏やかに吸い取り、プレートからすべての液体を除去します。
バイオセーフティキャビネット内の柔らかい薄暗いライトで次のステップを実行します。次に、液体処理システムを使用して、毎秒3.8マイクロリットルの吸引および分注速度で12.5マイクロリットルを各ウェルに分注することにより、25マイクロリットルのローディング染料を各ウェルに追加します。このピペッティングステップを繰り返して、各ウェルの最終容量25マイクロリットルに到達します。
完了したら、プレートをアルミホイルで覆い、周囲光から保護し、二酸化炭素加湿インキュベーター内で摂氏37度で30分間インキュベートします。カバープレートをさらに30分間平衡化した後、細胞はハイスループットスクリーニングまたはHTSの準備が整います。次に、薬剤プレートをプレート遠心分離機で1200 x gで1分間遠心分離します。
Rhimi-K-1の10倍アゴニストペプチド溶液を150ミリリットルの自動対応リザーバーに移します。プレートリーダーで、[プロトコルの管理]をクリックします。次に、エンドポイント蛍光強度プロトコルで、Flow Forteプレリードを選択し、測定開始をクリックして、HTSアッセイ全体のバックグラウンドシグナルを測定します。
セルプレートをプレートリーダーに挿入します。インストルメントパネルで、プレート上のランダムなウェルをクリックしてから、新しいフォーカスの高さをクリックします。フォーカス調整をクリックします。
ゲイン調整をクリックします。測定可能な最大蛍光値の5%から10%として割り当てます。[調整の開始] をクリックします。
[測定開始]をクリックして、相対蛍光単位またはRFUのバックグラウンド蛍光シグナルについてプレート全体を読み取ります。プレートの読み取り中に、現在の状態をクリックして、リアルタイムの読み取り値を確認します。二重添加アッセイでは、リキッドハンドリングシステムを使用して10マイクロリットルの薬液を3回上下にピペットし、毎秒1.0マイクロリットルの吸引速度で薬物プレートの各ウェルから1.5マイクロリットルを吸引します。
0.5マイクロリットルの化合物をセルアッセイに分注し、0.2%ジメチルスルホキシドまたはDMSOで2マイクロモルの最終濃度に達します。スクリーニング化合物を添加した後、アッセイプレートを直ちにプレートリーダーに入れます。プリセットの読み取りプログラムをクリックして、プレートを順方向と逆方向の読み取り方向に読み取ります。
チップに残っている1マイクロリットルの薬液を、約50ミリリットルのDPBSを含む150ミリリットルの廃棄物リザーバーに浸して廃棄します。スクリーニング化合物を細胞と一緒に、ライトを消した状態でバイオセーフティキャビネットのプレートリーダー内の時間を含めて、合計5分間インキュベートします。次に、384個の12.5マイクロリットルのチップを使用して、リザーバーから3マイクロリットルのアゴニストペプチドRhimi-K-1をリザーバーからアッセイプレートに追加します。
プレートをすぐにプレートリーダーに入れます。プリセットの読み取りプログラムをクリックして、プレートを順方向と逆方向の読み取り方向に読み取ります。手動で各プレートアッセイの品質管理のためのZ'factorを計算します。
オンラインHTSデータプラットフォームのヒートマップからヒット分子を手動で選択し、正規化された活性化率またはNPAおよび阻害活性、またはアゴニストヒットおよびアンタゴニストヒットのI0を計算します。このHTSアッセイを実証するために、320個のランダムな小分子で構成される社内の薬物プレートSAC2-34-6170を使用しました。HTSは、テストされた化合物に依存しないアッセイ品質を反映して、0.7のZ'factorで優れたアッセイ品質を有していました。
アゴニストを添加した直後にプレートを読み取ることは、蛍光シグナルが短命であるため、必須である。この手順の後、同定されたヒット分子は、用量反応アッセイを通じて検証され、オフターゲットヒットを排除するために標的GPCRを発現しない細胞で試験されるべきである。
