この方法により、SAMHD1によって加水分解される化学療法薬の特性を把握することができ、この酵素の低分子阻害剤を同定するためのスクリーニングアッセイとして使用できます。この技術の主な利点は、シンプルで安価であり、さまざまな低分子がこの酵素とどのように相互作用するかについて膨大な量の情報が得られることです。手順を実演するのは、グループのポスドクであるミリアムです。
まず、Tween-20 と TCEP をそれぞれ 0.005% と 0.3 mm の最終濃度に添加して、完全な SAMHD1 反応バッファーを調製します。完全なSAMHD1反応緩衝液にEDTAを最終濃度7.9ミリモルに添加して、EDTA停止溶液を調製します。10部のMGストック溶液を7%モリブデン酸アンモニウム2.5部および11%Tween-2000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000
マルチチャンネルピペットを使用して、透明な丸底ポリプロピレン製96ウェルプレートで、試験化合物を最終濃度の100倍に段階希釈します。さらに、これらの化合物を完全なSAMHD1反応バッファーで最終濃度の25倍に希釈し、最終溶媒濃度を1%未満に維持します 希釈した成分を5マイクロリットルの透明な384ウェル平底アッセイプレートの適切なウェルに移し、溶媒のみのコントロールサンプルで手順を繰り返します。酵素マスターミックス調製では、組換えヒトSAMHD1タンパク質および組換えピロホスファターゼを完全なSAMHD1反応バッファー中で、所望の最終濃度の4倍に希釈します。
溶液を完全なSAMHD1反応バッファーで希釈して活性化剤または基質dGTPを調製し、濃度を50マイクロモルにします。化合物希釈液と溶媒のみのコントロールを含むウェルに、5 μリットルの SAMHD1 ピロホスファターゼマスターミックスを分注し、酵素コントロールなしウェルに 5 マイクロリットルの完全 SAMHD1 反応バッファーを添加します。次に、10マイクロリットルのdGDP溶液をすべてのウェルに分注して反応を開始し、室温で20分間インキュベートします。
反応を止めるには、20マイクロリットルのEDTA停止溶液を添加する。すべてのウェルに10マイクロリットルのMG作業溶液を添加した後、オービタルマイクロウェルプレートシェーカーを使用して内容物を混合し、プレートを1000 x gで1分間遠心分離します。プレートを室温で20分間インキュベートし、マイクロウェルプレートリーダーで630ナノメートルでの吸収を読み取ります。
ポジティブコントロールウェルの標準偏差を計算してから、平均を計算します。同様に、ネガティブコントロールウェルについても、標準偏差を計算してから平均を計算します。Zファクターはアッセイ品質の指標です。
各吸光度値をポジティブコントロールとネガティブコントロールの平均値に正規化します。ポジティブコントロールを 100%SAMHD1 アクティビティとして設定し、ネガティブコントロールを 0%SAMHD1 アクティビティとして設定します。SAMHD1活性は化合物濃度の関数であり、4つのパラメータ可変スロープ用量反応曲線に適合し、化合物の半値阻害濃度を決定できます。
ヌクレオチドアナログストックと完全なSAMHD1反応バッファーを最終濃度の4倍に希釈し、5マイクロリットルを384ウェルアッセイプレートの適切なウェルに移します。酵素SAMHD1またはピロホスファターゼマスターミックスを調製するには、組換えヒトSAMHD1タンパク質および大腸菌ピロホスファターゼを完全なSAMHD1反応バッファー中で目的の最終濃度の2倍に希釈します。組換え大腸菌ピロホスファターゼを完全なSAMHD1反応バッファーで目的の最終濃度の2倍に希釈することにより、ピロホスファターゼ溶液のみを調製します。
同様に、完全なSAMHD1反応バッファーでストックを最終濃度の4倍に希釈することにより、活性化剤GTPおよびdGTPαSを調製します。5マイクロリットルの活性化剤(GDPまたはdGTP α Sまたは完全なSAMHD1反応バッファーのいずれか)を、ヌクレオチド類似体を含む384ウェルアッセイプレートの適切なウェルに分注します。10マイクロリットルのSAMHD1ピロホスファターゼマスターミックス、ピロホスファターゼ単独、または完全なSAMHD1反応バッファーを適切なウェルに分注し、室温で20分間インキュベートして反応を開始します。
EDTA停止溶液を使用して反応を停止した後、すべてのウェルに10マイクロリットルのMG作業溶液を添加します。内容物が混合されたら、プレートを1000 x gで1分間遠心分離し、室温で20分間インキュベートします。次に、630ナノメートルでの吸光度を測定します。
ピロホスファターゼのみの反応ウェルの平均吸光度値を計算し、これがバックグラウンド値になります。次に、SAMHD1またはピロホスファターゼ反応の対応するウェルからバックグラウンド値を差し引きます。最後に、バッファー GTP および dGTP α S 条件で各ヌクレオチド類似体の補正された吸光度値をプロットします。
本研究では、マラカイト緑色試薬とのインキュベーション後、リン酸ナトリウム濃度の上昇に伴って吸収剤が増加し、0.25ミリモル濃度で飽和に達しました。リン酸塩の線形検出範囲は、0.004〜0.03ミリモルで見ることができます。測定可能なSAMHD1活性を達成するためのアッセイ成分の要件を図示します。
SAMHD1もピロホスファターゼも、dGTPの存在下では有機リン酸を生成することができませんでした。しかし、すべてのアッセイ成分が存在すると、シグナルの増加が観察されました。SAMHD1阻害剤化合物について得られた用量反応曲線は、濃度の上昇がSAMHD1活性を効果的に阻害することを示しました。
ヒドロキシ尿素はin vitroでSAMHD1活性を阻害せず、これはヒドロキシ尿素の用量を増やしても影響を受けないSAMHD1活性によって示されました。.両方のアロステリック部位に結合するdGTPはSAMHD1を活性化し、このヌクレオチドのその後の加水分解を可能にしますが、他の3つの標準的なdNTPは、2番目のアロステリック部位に結合し、触媒部位で加水分解される前に、まず最初のアロステリック部位のGTP活性化を必要とします。ヌクレオチド類似体の場合、クロファラビン三リン酸はアロステリック部位の2活性化因子であり、活性がGTPの存在下で観察される基質である。
一方、シタラビン三リン酸はdGTPとして触媒部位しか占有できませんが、活性を観察するにはαSが必要です。ゲムシタビン三リン酸の活性は観察されませんでした。.このアッセイでSAMHD1を阻害する低分子をサーマルシフトアッセイなどの物理的アプローチで同定した後、ターゲットエンゲージメントを調べるために使用できます。
ここで紹介した方法は、SAMHD1によって加水分解される抗がん剤のどれかを理解し、この酵素を薬剤耐性を克服するための潜在的な治療標的として確立するのに役立ちました。
