紅藻生理機能を評価するための自己蛍光イメージング

この共焦点顕微鏡プロトコルは、色素の自家蛍光を使用して、実験室でゆっくりと成長する極端な環境からの微細藻類の生態学的行動と適応の解釈を可能にします。この技術は侵襲的ではなく、化合物を使用しないためアーチファクトを最小限に抑えます。独立栄養生物の色素の性能とそれに対応する成長を知ることで、観光洞窟や建築記念碑にとって最大の関心事である制御方法の設計が可能になります。

Chroothece mobilisの接種材料を寒天培養物から海水培地またはSWES液体培地に移すことによって準備を開始します。すべての培養物を、低い白色光強度の下で、所望の細胞密度が得られるまで振とうすることなく、摂氏20度で16〜8の明るい暗い写真期間で2週間維持する。1ミリリットルの細胞密度につき10〜3番目の細胞密度の5倍を有する1ミリリットルの指数相培養物を使用して、異なる実験のために24ウェルプレートに接種する。

単色光の効果を再現するには、緑色フィルターを使用して、506ナノメートルの波長にピークを持つ470〜570ナノメートルの緑色光を通過させ、590〜720ナノメートルのフィルターを使用して調整された赤色光と678ナノメートルのピークを通過させます。細胞培養物をこの光に2週間さらします。レーザーを含む倒立共焦点レーザー走査型顕微鏡のすべてのコンポーネントの電源を入れます。

SWES増殖培地中の細胞を、24ウェルプレートの各実験ウェルから35ミリメートルのガラス底皿にマウントしてイメージングします。63Xまたは1.30の絞り数またはNAグリセロール液浸対物レンズを選択し、グリセロールをレンズの上に置きます。次に、ウェルプレートを顕微鏡ステージに置き、画像取得中に標本が動かないようにします。

標本を光路の中心に配置し、蛍光強度が最も高い平面を選択して細胞の中心に焦点を合わせます。完了したら、画像取得ソフトウェアを開き、取得モードのドロップダウンリストからXYラムダを選択します。レーザーの励起線561ナノメートル、8ビットのダイナミックレンジ、1024 x 1024ピクセルを選択します。

10ナノメートル帯域幅の蛍光発光スペクトルと、570〜760ナノメートルの範囲内の4ナノメートルのラムダステップサイズを収集します。ピンホールを1つのエアユニットに設定し、ラムダスキャン取得を実行します。このプロセスをさまざまな視野で、赤と緑のライトのさまざまな条件下で繰り返した後、すべてのデータを保存します。

ラムダスキャンが取得されたら、ソフトウェアの上部にある定量ウィンドウをクリックして、収集された蛍光発光スペクトルを評価します。開いているプロジェクトウィンドウに移動し、XYラムダファイルを1つ選択します。イメージングソフトウェアでスタックプロファイル解析を選択し、細胞の中心に4マイクロメートル四方の関心領域を定義して、平均蛍光強度を分析します。

データとCSVをエクスポートしてから、さまざまな条件下でさまざまなセルでプロセスを繰り返す。次に、CSVファイルを開き、CSVファイル内のフィコエリスリンフィコシアノビリン、C.フィコシアニン、アロフィコシアニン、クロロフィルAの最大蛍光データをそれぞれ選択することにより、すべての測定対象領域の異なる蛍光発光ピークを選択します。完了したら、各フィコビリタンパク質とクロロフィルピークから得られたすべての最大蛍光値を含む新しいテーブルを作成し、データをグラフにプロットします。

平均蛍光強度に有意差は認められなかった。フィコエリスリンフィコシアノビリンの平均蛍光強度は、細胞が単色緑色光にさらされると有意に減少した。対照的に、対照と比較して赤色光に差は認められなかった。

緑色光は、アロフィコシアニンとクロロフィルAに逆の効果をもたらし、とりわけアンテナ複合体の量の増加または接続性の改善によるアンテナ複合体の適応により、平均蛍光強度が大幅に増加しました。赤色光は、アロフィコシアニンおよびクロロフィル蛍光の有意でない増加をもたらした。培養中の細胞に対するさまざまな増殖条件の影響を調べるには、まったく同じ顕微鏡設定で測定を行うことが重要です。

自家蛍光生物の培養に関連する他の環境パラメータや、可視スペクトル内の蛍光シグナルを分析することが可能です。この技術は、いくつかの自己蛍光色素を有する生命生物を研究するための非常に強力なアプローチである。