This work was supported by the European research council by a ERC starting/consolidator grant to RC and by the Dutch Foundation for research on matter (FOM) via a FOM program (10TM01).

ホウレンソウの葉から1全顔料の抽出<ol><li> 20秒間、ブレンダーを使用します（ 表1を参照）、コールド研削バッファー100mlにホウレンソウの葉（〜20グラム）の一方の握りをホモジナイズする。 </li><li> 4℃で10分間1500×gで20ミクロン遠心濾液の孔径を有するナイロン布の二つの層を通して溶液を濾過する。 </li><li>ソフトアーティストは冷たい洗浄バッファー（ 表1参照）1ml中にブラシをペイントして葉緑体を含むペレットを再懸濁します。ペレットを再懸濁した後、4℃で10分間、10,000×gで遠心洗浄緩衝液50mlの溶液を加える。 </li><li>上清を除去し、穏やかに（ 表1参照）の洗浄緩衝液50ml中にペレット（チラコイド）を懸濁します。 </li><li>遠心分離し、4℃で10分間、10,000×gで解決し、完全に上清を除去。この時点で、顔料の酸化を避けるために、暗闇の中で、以下のステップを実行する。 </李&gt; <li>色素を抽出する（ 表1参照）〜のNa 2 CO 3で緩衝し、80％アセトン20mlを加える。時折ボルテックス、10分間氷上で解決策をしておきます。 </li><li> 4℃で15分間12,000×gでの遠心分離により細胞成分のペレット。 NOTE：顔料が完全に抽出されない場合は、ペレットが緑色を有しており、1.6を繰り返すべきであるステップう。 </li><li>分液ロートに上清を収集します。ジエチルエーテルの0.4ボリュームを追加し、激しく振り、ガスを排出するためのバルブを開きます。 </li><li> 0.33 M NaClを0.8ボリュームを追加し、激しく混ぜる。層を分離するための〜10分を許可します。上部のエーテル相を抽出顔料が含まれています。明確な下相を除去します。 注：分離が明確でない場合、相分離を改善するための解決策を凍結し、解凍。 </li><li>適切なガラス容器に分液ロートの上から注ぐことによって、エーテルを除去します。グランのスプーンを追加することでドライウラル無水硫酸ナトリウム。溶液を旋回し、エーテルから水分を吸収する乾燥剤のために約5分を可能にする。 注：硫酸ナトリウムが完全に一緒に凝集しているような場合は、この手順を繰り返します。エーテルを十分に乾燥したとき、いくつかのフリーフローティングの結晶があるはずです。水層を形成した場合、追加の無水硫酸ナトリウムを添加する前に、パスツールピペットでこれを削除してください。 </li><li>背後に固体硫酸ナトリウムを残し、新しいガラス容器にエーテルをデカント。 </li><li>ロータリースピードバックでまたはN 2気流下でエーテルを蒸発。 </li><li> 100％のアセトン10mlに完全に色素を溶解する。 </li><li> 80％アセトン1ml中に少量（〜3μl）を希釈し、吸収スペクトルを測定し、クロロフィルa / bの比とPorra らによって記載された方法とクロロフィル濃度を決定する。 （1989）15。 </li><li>アセトンになるまで一定分量を、ロータリースピードバック中またはN 2気流下で顔料を乾燥完全に蒸発。 -80℃で乾燥した顔料を格納します。 </li></ol>ホウレンソウからカロテノイドの2の抽出<ol><li> 、手順1.1〜1.5に従ってください。この時点で、顔料の酸化を避けるために、暗闇の中で、以下のステップを実行する。 </li><li>色素を抽出する（ 表1参照）のNa 2 CO 3で緩衝〜50ミリリットルの96％エタノール中にチラコイドペレットを再懸濁する。 5分間氷上で解決策をしておきます。 </li><li> 4℃で15分間12,000×gでの遠心分離により細胞成分のペレット。 NOTE：顔料が完全に抽出されない場合は、ペレットが緑色を有しており、2.2を繰り返すべきであるステップう。 </li><li>上清を収集し、（w / v）のケン化を開始するために80％のKOH 0.1ボリュームを追加。 </li><li> 4℃のCO / Nで溶液のままにし、しっかりと蓋をし、光から保護。 </li><li>分液ロートに溶液を収集します。ジエチルエーテルの1ボリュームを追加し、穏やかに混合。 </li><li> 0.8巻を追加0.33 M NaClをリューム、穏やかに混合。層を分離するための〜10分を許可します。上部のオレンジ色のエーテル相をケン化カロテノイドが含まれています。漏斗のストップコックを介して排出することによって、グリーン下相を除去します。 </li><li>水3容量を追加し、水酸化カリウムを除去するために穏やかに混合。層を分離することを許可する。注：上相が濁って表示された場合は、塩化ナトリウム（溶液200ml中のNaClの例、3グラム）を少量添加し、溶解するために穏やかに旋回。 </li><li>漏斗のストップコックを介して排出することによって下相を除去します。 </li><li> 、手順1.13に1.10に従ってください。 </li><li> 80％アセトン1ml中に少量（〜3μl）を希釈し、80％アセトン中で440 nmでの吸収スペクトルを測定する。濃度を決定するために、カロテノイドの平均係数絶滅を使用し、以下の式16（440 = 255ε）：カー[mg / mlの] =（ABS 440nmで / 225）×11（光路）= 1センチメートル。 </li><li> carotenoiを分注し、乾燥スピードバック中またはN 2気流下dsはすべてジエチルエーテルが蒸発されるまで。 -80℃で乾燥した顔料を格納します。 </li></ol> クラミドモナスから3全顔料とカロテノイドの抽出<ol><li> C.を育てる表面に液体培養の少量を広げることにより、シャーレ中の固体TAP培地17上のクラミドモナス 。細胞の緑色の層が表示されるまで20マイクロモルの写真の連続照明フラックスのPSAメートル-2秒-1の下で成長する。 </li><li>無菌接種ループを用いて、C.少量の収穫固体TAP培地からクラミドモナスとを1Lフラスコ中でTAP培地17 500ml中に細胞を置く。 20マイクロモルの写真の連続照明フラックスのPSAメートル-2秒-1の下で170rpmで攪拌しながら25℃で文化を育てる。 </li><li> 5-6日後、培養液を対数期（6×10 6細胞/ mlでの最後に到達する必要がありまたは750 nmで2〜2.5の光学密度）。遠心し、4℃で15分間、4,000×gで文化。 </li><li>全顔料抽出には、ステップ1.15に1.6に従ってください。 </li><li>全顔料抽出物の収率は、Cの完全な増殖培養の500ミリリットルから始まるクラミドモナスは、0.5mgのCHL a + b の / mlの濃度で遊ん5ミリリットルの溶液である。 </li><li>カロテノイドの抽出のために、ステップ2.12に2.2に従ってください。 </li></ol>封入体の精製4。 <ol><li>標準的な分子生物学的手順を用いて融合したC末端Hisタグをもたらす発現ベクターに目的のLHCタンパク質のコード配列をクローニングする。 E.に、この構築物を変換するそのようなBL21（DE3）などの大腸菌宿主株。 </li><li>準備溶解緩衝液、洗剤緩衝液、トリトン緩衝液、TE（ 表1）、1 Mイソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド（IPTG）および適切な抗生物質を含むLB培地18。 </li><li> SINGLピック電子E.標準的な手順6を用いて、適切な抗生物質を含むLB培地約5中へ新たに画線し、プレートからの発現クローンを含む大腸菌コロニー 。少なくとも16時間、220rpmで攪拌​​しながら37℃で成長させる。 </li><li> LBの250ミリリットルと1リットルの三角フラスコに、O / N培養の2.5ミリリットルを追加し、適切な抗生物質を補充した。 </li><li> （OD 600が 〜0.6になるまで、または）、220rpmで、37℃で2〜3時間細胞を成長させる。 </li><li> 1 mMの最終濃度までIPTGを追加します。 220rpmで3〜4時間、37℃で細胞を増殖し続ける。 </li><li>予め秤量した遠心管中、4℃で5000×gで10分間の文化を遠心します。徹底的に上澄みを捨て、再び計量し、遠心管の重量を差し引くことにより、重量のペレットを決定。 </li><li> E.を再懸濁0.8ミリリットル/激しいボルテックスによる溶解バッファーのg中の大腸菌細胞ペレット。 注：あるいは、細胞ペレットを-80℃で凍結することができ後で使用するためのC。凍結したペレットで始まる場合は、溶解バッファーを追加する前に、完全に解凍することができます。 </li><li>細胞1グラム当たりのリゾチーム2mgを追加し、30分間、時折ボルテックスで濡れた氷上でインキュベートする。 </li><li> 20μg/ mlのDNA分解酵素、10mMのMgCl 2、1のNaCl、20μg/ mlのRNA分解酵素を追加します。ボルテックスし、30分間氷上に置く。 </li><li>細胞1グラムあたりの冷洗剤緩衝液2mlを加える。よく混合し、5分間、室温を保つ。 </li><li> 2ミリリットルの遠心管への転送は、（必要に応じて2のチューブに分割）。 4℃で12,000×gで10分間遠心分離し、封入体をペレット化する。 </li><li>冷たいトリトン緩衝液1mlを加え、完全に超音波処理することによりペレットを再懸濁し（20秒間隔で3パルス×5秒×50％出力）。注：超音波処理の間、寒さを保つために氷水に囲まれた小さなビーカーにチューブを持っている。複数のチューブの場合には、再懸濁した後に1チューブに再懸濁し、封入体を兼ね備えています。 </li><li> 12,000で10分間遠心分離4℃での遠心は、封入体をペレット化する。 </li><li>繰り返し手順4.13と4.14の2倍。 </li><li> Tritonバッファーを除去するための最終洗浄のために超音波処理を使用してコールドTE 1ml中封入体を再懸濁します。 4℃で12,000×gで10分間遠心分離し、封入体をペレット化する。 </li><li>超音波処理による風邪のTE 1ml中にペレットを再懸濁。 </li><li>そのようなブラッドフォードアッセイ19などの標準的な方法によってタンパク質濃度を評価する。 -20℃で封入体のストア分量。 </li></ol> 5。再構成吸光度はQyは地域（600〜750ナノメートル）で測定されている場合、このプロトコルは、典型的には4のODで再構成したタンパク質1〜2mlのが得られます。注意を手術中に適切な比率を維持するように注意すべきである量は、所望のように調節することができる。 <ol><li> 2X再構成緩衝液、20％OG、2 MのKCl、TE： 表1に記載したように、以下の溶液を調製する。以下のを実行します薄暗い光の中でTEPS。 </li><li> 2ミリリットルの微量遠心管中で400μlのTEの合計LHC封入体の800μgの再懸濁する。 2倍の再構成バッファと渦簡単に400μlのを追加します。 </li><li> 10 mMの最終濃度が、β-メルカプトエタノール（株式14.8 M）0.6を添加する。 98℃で1分間、タンパク質を加熱する。 3分間室温でボルテックス簡潔にと場所。 </li><li>精力的に1-2分間入浴ソニケーターで1分間、または場所をボルテックスすることによって30μlの100％エタノールの総乾燥したクロロフィル色素の500μgのプラス80μgのカロテノイド色素を懸濁します。 </li><li> 4℃で15,800×gで〜30秒顔料ミックスをスピンしてないペレットがないことを確認してください。ペレットがある場合は、ボルテ​​ックスおよび/または超音波処理を繰り返します。重要：再懸濁し、スピンした後、すぐにタンパク質に顔料を追加したり、それを集約することができますし、再び再懸濁する必要があります。 </li><li>ボルテックスしながらゆっくりと冷却してタンパク質に顔料ミックスを追加します。ボルテックス5-10 sに進みますECおよび湿った氷上にチューブを配置すること。タンパク質がチューブの上部をオーバーフローすることができますようにあまりにも積極的にボルテックスしないように注意してください。 </li><li> 、20％のオクチルβ-D-グルコピラノシド（OG）（最終濃度2％）の94μl加え簡単にボルテックスし、氷上で10分間保つ。 </li><li> 、塩化カリウム2 M（最終濃度150〜200 mM）を90μl加え手短にボルテックスし、氷上で20分間続ける。注：カラム調製（第6節）は、この時点で開始することができます。 </li><li> 4℃で15,800×gで10分間スピン。 10ミリリットルチューブに（LDS沈殿した）ペレットを乱すことなく、上清を取り除きます。寒さと、光から保護してください。 </li></ol> 6。ニッケルカラム精製<ol><li> OG緩衝液、OGリンス緩衝液、溶出バッファー： 表1に記載したように、以下の溶液を調製する。 </li><li>空気が、このステップと次のステップの間に、列の中に入っていないことを確実にする蠕動ポンプにニッケルセファロースカラム（1ミリリットル）または同等を接続します。 </li><li> Tの速度を設定します彼は1ミリリットル/分にポンプおよびストレージ·ソリューションを除去するために水5〜10mlのカラムをすすいでください。 </li><li> OGバッファ3-4 mlのカラムを平衡化する。 </li><li>カラムにタンパク質試料負荷にOGバッファ3-4 mlを加え。注記：タンパク質はLDSの除去後10分よりも長い間、氷上で座っている場合には、追加のLDS沈殿を除去するために1分間、4℃で15,800×gで再度スピン。 </li><li> OG緩衝液5mlでカラムを洗浄します。 </li><li> OGリンス緩衝液2mlでカラムを洗浄します。 </li><li> 3ミリリットルの溶出バッファーで結合したタンパク質を溶出。再構成されたタンパク質が含まれている緑色の溶出を収集します。注：これは通常、合計で約1ミリリットルである。 </li></ol> 7。スクロース勾配遠心<ol><li>ショ糖溶液、0.06％のβ-DM、0.01MのHEPES、pH7.6の表1に記載したように、以下の溶液を調製する。 </li><li>ショ糖溶液を用いて超遠心管を記入し、CO / N O -20℃で凍結rは-80°Cのために少なくとも1時間。 </li><li>冷凍庫からチューブを外し、4℃で邪魔されずに解凍することができます。注：凍結/解凍工程は、0.1〜1Mのスクロース勾配を作成します。 15mlチューブは、典型的には約3時間で解凍。 </li><li>慎重にステップ6.8のニッケルセファロースカラムから溶出された緑色の画分として、上から同じボリュームを削除します。その後、勾配を乱さないようにゆっくりと上に再構成されたサンプルをロードします。 </li><li>加速とブレーキなしで停止を遅らせるように設定18時間SW-41またはSW-60スウィングローターを使用して、超遠心分離機内のバランス管4℃200,000×gでスピン。 </li><li>慎重にピンセットでチューブホルダの勾配を取り出します。トップからの画分を収集する鈍い開口部を有する長い針と注射器を使用してください。注：別の方法として、針でチューブを穿刺し、滴を収集することにより、下からの画分を収集します。 </li></ol>

The authors declare no conflict of interest

膜タンパク質は勉強するのは簡単ではありません。天然の膜タンパク質の単離は、タンパク質を損傷し、必須の補因子を除去することができる界面活性剤と脂質二重層を可溶化する必要性によって複雑になる。これらのタンパク質は、集光性複合体の場合のように、それは、単一の複合体の精製が困難になる、また、生体膜において低レベルで存在するかもしれない、または密接に関連するタンパク質と混合する。 E.における異種タンパク質の発現大腸菌およびインビトロでの再構成中 これらの問題を回避する可能性を提供する。従ってネイティブ複合体20,21,23とのものと非常に類似した特性を有する複合体におけるインビトロ再構成および折り畳まれたタンパク質の精製の ​​結果が均質24にまで精製することができない複合体を研究するために使用することができ- 27。 この方法は簡単にattainabさほうれん草を使用しています全顔料及​​びカロテノイド調製物のためのソースとしてル一年中、。藻類に対する天然のタンパク質のいくつかの再構成のために、藻類から精製された顔料の使用は、異なる顔料組成物に好適である。クロロフィルa / bの比およびクロロフィル/車比に関係なく、顔料ソースの同じままである。 これは、再構成の効率は通常約35％で28であることを認識することが重要です。したがって、再構成後の溶液から非結合顔料および折り畳まれていないアポタンパク質を除去することが必要である。二段階精製プロトコルは、（また結果を参照）、このプロトコルで提示される。しかし、ショ糖勾配ステップはアポとホロタンパク質の完全な分離を可能にしないことに留意すべきである。アポタンパク質は、機能的測定を妨害しない、したがって顔料を含有しない限り、ほとんどの分析のため、これは問題ではない。しかし、ケースでは、完全に、FRからアポタンパク質を除去することが必要である再構成された複合体（例えば、タンパク質の化学量論に顔料を計算する）を含有するアクションは、陰イオン交換カラムは、（参照Passarini ら詳細については2009年）を使用することができる。 試験管内で孤立した顔料を用いて、組換え集光タンパク質をリフォールディングする能力は、それによって得られた複合体の特性を変化させる、さまざまな方法で再構成「環境」を変更することにより、複合体を「操る」する機会を提供する。例えば、再構成中の顔料組成物を変更すると、変更された顔料組成物との複合体をもたらすことができる。この機能は、各種顔料を複合体の構造および安定性に及ぼす影響を調べるために利用することができる。 1と2.9のクロロフィル/車比：1通常ホウレンソウから得られた顔料調製物は、3のクロロフィルa / bの比を有する。この比率は、一般的にn個と同じ性質を用いて再構成タンパク質を産生する1をative。 33 -しかし、精製されたクロロフィルAまたはBの添加によりクロロフィルa / bの比の調整は、結合部位30の選択性を変化させることに起因する異なる顔料の結合に影響を与えることができる。顔料の結合部位の大部分はクロロフィルa またはクロロフィルbのための完全に選択的ではないが、異なる親和性10,30,34であるが、両方を収容することができるので可能である。 38 -同様に、カロテノイド結合部位はまた、複数のキサントフィル種8,35に対応できることが示された。 CP26、各種の顔料組成物を用いて、高等植物、他の色素-タンパク質複合体の別の再構成は、 表2 39に示されている。これらの再構成は、特定の顔料39の結合部位の親和性を評価した。これは、同じ顔料cを有する複合体を得るために、ことに留意することが興味深い。1：ネイティブ一つとしてompositionは、顔料ミックスのクロロフィルa / bの比は3でなければなりません。これは高等植物20,40のすべてのLHC複合体のためのケースであると思われる。 再構成技術を用いて、分子生物学の組み合わせがクロロフィル結合複合体の性質をより詳細に研究することができます。 44 -異なるタンパク質複合体の安定性及び折り畳みドメイン、またはタンパク質-タンパク質相互作用への関与の重要性は、アポタンパク質を切り捨てる又はランダム突然変異誘発8,41を実行することによって決定されている。 52 -異なる顔料の調整のための重要な単一のアミノ酸残基は、個別の顔料の特性を分析したり、複雑な10,28,29,45の機能および安定性への寄与を評価するために、部位特異的変異誘発によって変更することができる。 図6ははと​​Lhcb4（CP29）を再構成した位置216 53位のヒスチジンの変異。野生型および突然変異体複合体の顔料組成物の比較は、変異が標的部位は、WT複合体中のクロロフィルa を収容することを示す、分子1クロロフィルの喪失を誘導することを示す。 WTおよび変異体の吸収スペクトルの違いは、顔料の含有量に対して正規化の際に、また、失われた顔料の吸収特性を示している。この場合、差はクロロフィルHis216によってコーディネートこの波長で吸収する（この変異体についての詳細は、分光特性がモッツォら 、2008年53参照 ）ことを示し、680nmでの主ピークに見ることができる。変異分析はまた、顔料54の分光特性に及ぼす環境の影響を決定するために用いることができる。 結論として、集光性タンパク質は、容易に顔料proteiその結果、in vitroで再構成することができる天然の複合体と非常に類似した特性を有するn複合体。また、さらなる研究のために高い収率および純度でタンパク質調製物を提供しながらこのように、天然のタンパク質を単離することの困難さは、排除される。 3の重要性：本物の複合体の製造における1クロロフィルa / bの比が強調され、再構成された野生型および変異LHCsの実施例は、技術の応用を説明するために提供される。

植物や藻類の光合成装置は、膜内在性（CHL a）のクロロフィル a を結合するタンパク質、B（クロロフィルb）およびカロテノイド（車）が挙げられる。これらの色素-タンパク質複合体は、収穫光エネルギーで活性であり、それが電荷分離2を促進するために使用される反応中心にその励起エネルギーを伝達する。それらはまた、高い光損傷3,4から光合成装置を保護調節フィードバック機構に関与している。集光複 ​​合体（LHCs）は植物や藻類5の関連タンパク質の大きなファミリーで構成されている。 ファミリーの各メンバーの均質な精製は、複合体の高度に類似の化学的及び物理的性質によって複雑化されている。また、精製手順は、しばしば、顔料または脂質などの他の潜在的な補因子の損失をもたらす。 インビトロ再構成representsは強力な方法は、これらの問題を克服する。光化学系II（LHC-II）に関連付けられているLHCは、最初1987年1 Plumleyとシュミットによってin vitroで再構成された。研究者は、植物の葉緑体とは別に脱脂タンパク質及び顔料を抽出した後、リチウムの存在下での顔料と熱変性タンパク質を組み合わせた凍結融解1の3つのサイクルが続くドデシル硫酸（LDS）、。これらは、再構成されたLHC複合体のスペクトル特性は、植物から精製された複合体と非常に類似していたことを示した。何らかの固有の自己組織化機能への可能性が高いLHC顔料 - タンパク質複合体を再構成の容易さは、生物から精製された複合体を単離することが困難であるとともに、他の研究者による方法の迅速な採択につながった。 大腸菌（E. coli）で過剰発現光合成タンパク質の再構成1990年6ポールセンらによって達成された。E.で大腸菌は、過剰発現した膜タンパク質は、典型的には、その設備のそれらの精製、封入体に含まれている。再構成は、タンパク質の折り畳みを開始する顔料を添加したLDSの存在下で組換えタンパク質を含有する封入体の熱変性によって達成される。 LHCII複合体の折り畳みは、2段階のプロセスである：まず、 クロロフィル a が 1分以内に結合している;第二、 クロロフィル b は、数分7かけ結合し、安定化される。 フォールディング動力学への洞察を提供することに加えて、部位特異的突然変異誘発と組み合わせたインビトロでの再構成において安定性（ 例えば、8,9）または顔料の調整（ 例えば、10）に特異的なアミノ酸の同定が重要で可能にした。そのような顔料組成物または洗剤のようなパラメータを調整することによってリフォールディング条件の操作はまた、要素criticaを同定したそのようなLHCIIコンプレックスのキサントフィルの要件として適切な折り畳みのためのL（ 例えば、1,11）。さらに、複合体に結合された個別の顔料の特性の調査は生体内で再構成された複合体を使用可能であった（ 例えば、10）。 ここで説明する方法は、ほうれん草と緑藻クラミドモナスから色素（クロロフィルやカロテノイド）を単離することから始まる。EからLHCのタンパク質の発現および精製封入体の形で大腸菌を LHCとNiアフィニティーカラムによるその後の精製の ​​再構成に続いて、次に詳細に説明する。最後のステップでは、再構成された複合体はさらに自由顔料および折り畳まれていないアポタンパク質を除去するために、スクロース勾配遠心分離により精製される。このプロトコルは、以上の異なる研究所によって導入されたいくつかの変更を組み込んだ最適化された手順を示して時間1,6,10,12 -14。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="617">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:115px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">&#160;HisTrap HP</td>
			<td style="width:115px;">GE Healthcare</td>
			<td>17-5247-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nylon cloth&#160;</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>20 &#956;m pores</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Soft artists paint brush&#160;</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NONIDET P-40</td>
			<td style="width:115px;">Sigma</td>
			<td>74385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Beta-DM</td>
			<td style="width:115px;">Sigma</td>
			<td>D4641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">DNAase</td>
			<td style="width:115px;">ThermoScientific</td>
			<td>EN0525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Milk Powders</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">RNAase</td>
			<td style="width:115px;">ThermoScientific</td>
			<td>EN0531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sonicator</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Octyl &#946;-D-glucopyranoside</td>
			<td style="width:115px;">Sigma</td>
			<td>O8001&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ultracentrifuge XL</td>
			<td style="width:115px;">Beckman-Coulter</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">TAP medium</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>see reference 17</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">LB medium</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>see reference 19</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro reconstitution of light-harvesting complexes of plants and green algae

植物および緑藻類では、光は光捕集複合体（LHCs）、クロロフィルおよびカロテノイド座標内在性膜タンパク質のファミリーによって捕捉される。 インビボでは 、これらのタンパク質はチラコイド膜に挿入されている複合体を形成する顔料を用いて折り畳まれる葉緑体の。ファミリーのメンバーの化学的および物理的特性の高い類似性は、一緒に彼らは簡単に単離中の顔料を失う可能性があるという事実と、天然の状態での精製が困難なことができます。 LHCsの均質な調製物を得るための別のアプローチは、それが天然のものと非常に類似した特性を有する複合体が得られる、精製された顔料および折り畳まれていないアポタンパク質から出発して、インビトロでこれらの複合体を再構成することが可能であったことを示した1987年1 Plumleyシュミットによって開発された複合体。これは、in vitro細菌発現された組換えタンパク質の使用への道を開い</eM&gt;再構成。再構成方法は、さまざまな理由で強力である：（1）個別の複合体の純粋な調製物を得ることができる、（2）顔料組成物は、構造と機能するようにそれらの寄与を評価するように制御することができる、（3）組換えタンパク質は、機能を研究するために突然変異させることができる個別の残基（ 例えば、顔料結合部位）、またはタンパク質ドメイン（ 例えば、タンパク質-タンパク質相互作用、フォールディング）の役割。この方法は、いくつかの研究室で最適と光捕集複合体の大部分に適用されている。ここに記載されているプロトコルは、現在、私たちの研究室で使用されるin vitroでの集光性複合体を再構成する方法を詳述 および方法の用途を説明する実施例を提供する。

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Reconstitution of Light-harvesting Complexes of Plants and Green Algae at JoVE.com

In Vitro Reconstitution of Light-harvesting Complexes of Plants and Green Algae

This protocol details the reconstitution of light-harvesting complexes in vitro. These integral membrane proteins coordinate chlorophylls and carotenoids and are responsible for harvesting light in higher plants and green algae.

植物や緑藻の光捕集複合体のin vitro再構成では、

In plants and green algae, light is captured by the light-harvesting complexes (LHCs), a family of integral membrane proteins that coordinate chlorophylls ...

in-vitro-reconstitution-light-harvesting-complexes-plants-green

Research

JoVE Journal

Biology

In Vitro Reconstitution of Light-harvesting Complexes of Plants and Green Algae

18.0K ビュー.  VU University Amsterdam. This protocol details the reconstitution of light-harvesting complexes in vitro. These integral membrane proteins coordinate chlorophylls and carotenoids and are responsible for harvesting light in higher plants and green algae.

ビデオ: In Vitro Reconstitution of Light-harvesting Complexes of Plants and Green Algae

Single-Molecule Imaging of Nuclear Transport

The utility of single molecule fluorescence microscopy approaches has been proven to be of a great avail in understanding biological reactions over the last decade. The investigation of molecular interactions with high temporal and spatial resolutions deep within cells has remained challenging due to the inherently weak signals arising from individual molecules. Recent works by Yang et al. demonstrated that narrow-field epifluorescence microscopy allows visualization of nucleocytoplasmic transport at the single molecule level. By the single molecule approach, important kinetics, such as nuclear transport time and efficiency, for signal-dependent and independent cargo molecules have been obtained. Here we described a protocol for the methodological approach with an improved spatiotemporal resolution of 0.4 ms and 12 nm. The improved resolution enabled us to capture transient active transport and passive diffusion events through the nuclear pore complexes (NPC) in semi-intact cells. We expect this method to be used in elucidating other binding and trafficking events within cells.

Single molecule microscopy approch provided novel insights into nuclear transport.

核輸送の1分子イメージング

The utility of single molecule fluorescence microscopy approaches has been proven to be of a great avail in understanding biological reactions over the ...

生物学

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

アクティブT.の試験管内再構成でcastaneumのテロメラーゼ

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Biochemical Reconstitution of Steroid Receptor&#x2022;Hsp90 Protein  Complexes and Reactivation of Ligand Binding

Hsp90 is an essential and highly abundant molecular chaperone protein that has been found to regulate more than 150 eukaryotic signaling proteins, including transcription factors (e.g. nuclear receptors, p53) and protein kinases (e.g. Src, Raf, Akt kinase) involved in cell cycling, tumorigenesis, apoptosis, and multiple eukaryotic signaling pathways 1,2. Of these many 'client' proteins for hsp90, the assembly of steroid receptor&bull;hsp90 complexes is the best defined (Figure 1). We present here an adaptable glucocorticoid receptor (GR) immunoprecipitation assay and in vitro GR&bull;hsp90 reconstitution method that may be readily used to probe eukaryotic hsp90 functional activity, hsp90-mediated steroid receptor ligand binding, and molecular chaperone cofactor requirements. For example, this assay can be used to test hsp90 cofactor requirements and the effects of adding exogenous compounds to the reconstitution process. 
The GR has been a particularly useful system for studying hsp90 because the receptor must be bound to hsp90 to have an open ligand binding cleft that is accessible to steroid 3. Endogenous, unliganded GR is present in the cytoplasm of mammalian cells noncovalently bound to hsp90. As found in the endogenous GR&bull;hsp90 heterocomplex, the GR ligand binding cleft is open and capable of binding steroid. If hsp90 dissociates from the GR or if its function is inhibited, the receptor is unable to bind steroid and requires reconstitution of the GR&bull;hsp90 heterocomplex before steroid binding activity is restored 4 . GR can be immunoprecipitated from cell cytosol using a monoclonal antibody, and proteins such as hsp90 complexed to the GR can be assayed by western blot. Steroid binding activity of the immunoprecipitated GR can be determined by incubating the immunopellet with [3H]steroid. 
Previous experiments have shown hsp90-mediated opening of the GR ligand binding cleft requires hsp70, a second molecular chaperone also essential for eukaryotic cell viability. Biochemical activity of hsp90 and hsp70 are catalyzed by co-chaperone proteins Hop, hsp40, and p23 5. A multiprotein chaperone machinery containing hsp90, hsp70, Hop, and hsp40 are endogenously present in eukaryotic cell cytoplasm, and reticulocyte lysate provides a chaperone-rich protein source 6. 
In the method presented, GR is immunoadsorbed from cell cytosol and stripped of the endogenous hsp90/hsp70 chaperone machinery using mild salt conditions. The salt-stripped GR is then incubated with reticulocyte lysate, ATP, and K+, which results in the reconstitution of the GR&bull;hsp90 heterocomplex and reactivation of steroid binding activity 7. This method can be utilized to test the effects of various chaperone cofactors, novel proteins, and experimental hsp90 or GR inhibitors in order to determine their functional significance on hsp90-mediated steroid binding 8-11.

Biochemical Reconstitution of Steroid Receptor&amp;#x2022;Hsp90 Protein  Complexes and Reactivation of Ligand Binding

An in vitro method for preparing functional glucocorticoid receptor (GR)&#x2022;hsp90 protein complexes from purified proteins and cellular lysates is described. The method utilizes immunoadsorption of recombinant GR followed by salt-stripping and protein complex reconstitution. The importance of cofactors and buffer conditions are discussed, as are potential method applications.

ステロイド受容体の生化学的再構成には、•Hsp90のタンパク質複合体とリガンド結合の再活性化

Hsp90 is an essential and highly abundant molecular chaperone protein that has been found to regulate more than 150 eukaryotic signaling proteins, ...

In Vitro Analysis of PDZ-dependent CFTR Macromolecular Signaling Complexes

Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR), a chloride channel located primarily at the apical membranes of epithelial cells, plays a crucial role in transepithelial fluid homeostasis1-3. CFTR has been implicated in two major diseases: cystic fibrosis (CF)4 and secretory diarrhea5. In CF, the synthesis or functional activity of the CFTR Cl- channel is reduced. This disorder affects approximately 1 in 2,500 Caucasians in the United States6. Excessive CFTR activity has also been implicated in cases of toxin-induced secretory diarrhea (e.g., by cholera toxin and heat stable E. coli enterotoxin) that stimulates cAMP or cGMP production in the gut7.
Accumulating evidence suggest the existence of physical and functional interactions between CFTR and a growing number of other proteins, including transporters, ion channels, receptors, kinases, phosphatases, signaling molecules, and cytoskeletal elements, and these interactions between CFTR and its binding proteins have been shown to be critically involved in regulating CFTR-mediated transepithelial ion transport in vitro and also in vivo8-19. In this protocol, we focus only on the methods that aid in the study of the interactions between CFTR carboxyl terminal tail, which possesses a protein-binding motif [referred to as PSD95/Dlg1/ZO-1 (PDZ) motif], and a group of scaffold proteins, which contain a specific binding module referred to as PDZ domains. So far, several different PDZ scaffold proteins have been reported to bind to the carboxyl terminal tail of CFTR with various affinities, such as NHERF1, NHERF2, PDZK1, PDZK2, CAL (CFTR-associated ligand), Shank2, and GRASP20-27. The PDZ motif within CFTR that is recognized by PDZ scaffold proteins is the last four amino acids at the C terminus (i.e., 1477-DTRL-1480 in human CFTR)20. Interestingly, CFTR can bind more than one PDZ domain of both NHERFs and PDZK1, albeit with varying affinities22. This multivalency with respect to CFTR binding has been shown to be of functional significance, suggesting that PDZ scaffold proteins may facilitate formation of CFTR macromolecular signaling complexes for specific/selective and efficient signaling in cells16-18.
Multiple biochemical assays have been developed to study CFTR-involving protein interactions, such as co-immunoprecipitation, pull-down assay, pair-wise binding assay, colorimetric pair-wise binding assay, and macromolecular complex assembly assay16-19,28,29. Here we focus on the detailed procedures of assembling a PDZ motif-dependent CFTR-containing macromolecular complex in vitro, which is used extensively by our laboratory to study protein-protein or domain-domain interactions involving CFTR16-19,28,29.

In Vitro Analysis of PDZ-dependent CFTR Macromolecular Signaling Complexes

Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR), an epithelial chloride channel, has been reported to interact with various proteins and regulate important cellular processes; among them the CFTR PDZ motif-mediated interactions have been well documented. This protocol describes methods we developed to assemble a PDZ-dependent CFTR macromolecular signaling complex in vitro.

PDZ-依存性のCFTRの高分子シグナル伝達複合体のin vitroでの解析で

Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR), a chloride channel located primarily at the apical membranes of epithelial cells, plays a ...

AFM-based Mapping of the Elastic Properties of Cell Walls: at Tissue, Cellular, and Subcellular Resolutions

We describe a recently developed method to measure mechanical properties of the surfaces of plant tissues using atomic force microscopy (AFM) micro/nano-indentations, for a JPK&#160;AFM. Specifically, in this protocol we measure the apparent Young&#8217;s modulus of cell walls at subcellular resolutions across regions of up to 100 &#181;m&#160;x 100 &#181;m in floral meristems, hypocotyls, and roots. This requires careful preparation of the sample, the correct selection of micro-indenters and indentation depths. To account for cell wall properties only, measurements are performed in highly concentrated solutions of mannitol in order to plasmolyze the cells and thus remove the contribution of cell turgor pressure.
In contrast to other extant techniques, by using different indenters and indentation depths, this method allows simultaneous multiscale measurements, i.e. at subcellular resolutions and across hundreds of cells comprising a tissue. This means that it is now possible&#160;to spatially-temporally characterize the changes that take place in the mechanical properties of cell walls during development, enabling these changes to be correlated with growth and differentiation. This represents a key step to understand how coordinated microscopic cellular changes bring about macroscopic morphogenetic events.
However, several limitations remain: the method can only be used on fairly small samples (around 100 &#181;m in diameter) and only on external tissues; the method is sensitive to tissue topography; it measures only certain aspects of the tissue&#8217;s complex mechanical properties. The technique is being developed rapidly and it is likely that most of these limitations will be resolved in the near future.

We describe a method to map mechanical properties of plant tissues using an atomic force microscope (AFM). We focus on how to record mechanical changes that take place in cell walls during plant development at wide-field mesoscale, enabling these changes to be correlated with growth and morphogenesis.

細胞壁の弾性特性のAFMベースのマッピング：ティッシュ、携帯電話、および細胞内の解像度で

We describe a recently developed method to measure mechanical properties of the surfaces of plant tissues using atomic force microscopy (AFM) ...

Reconstitution Of &#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has been used to study protein turnover in many cellular contexts, including the cell cycle and signal transduction pathways1-3. Herein, a method is described for isolating Xenopus egg extract that has been optimized to promote the degradation of the critical Wnt pathway component, &beta;-catenin. Two different methods are described to assess &beta;-catenin protein degradation in Xenopus egg extract. One method is visually informative ([35S]-radiolabeled proteins), while the other is more readily scaled for high-throughput assays (firefly luciferase-tagged fusion proteins). The techniques described can be used to, but are not limited to, assess &beta;-catenin protein turnover and identify molecular components contributing to its turnover. Additionally, the ability to purify large volumes of homogenous Xenopus egg extract combined with the quantitative and facile readout of luciferase-tagged proteins allows this system to be easily adapted for high-throughput screening for modulators of &beta;-catenin degradation.

Reconstitution Of &amp;#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

A method is described for analyzing protein degradation using radiolabeled and luciferase-fusion proteins in Xenopus egg extract and its adaptation for high-throughput screening for small molecule modulators of protein degradation.

β-カテニンの分解にの再構成<em&gt;アフリカツメガエル</em&gt;卵抽出

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has ...

Measuring Spatial and Temporal Ca2+ Signals in Arabidopsis Plants

Developmental and environmental cues induce Ca2+ fluctuations in plant cells. Stimulus-specific spatial-temporal Ca2+ patterns are sensed by cellular Ca2+ binding proteins that initiate Ca2+ signaling cascades. However, we still know little about how stimulus specific Ca2+ signals are generated. The specificity of a Ca2+ signal may be attributed to the sophisticated regulation of the activities of Ca2+ channels and/or transporters in response to a given stimulus. To identify these cellular components and understand their functions, it is crucial to use systems that allow a sensitive and robust recording of Ca2+ signals at both the tissue and cellular levels. Genetically encoded Ca2+ indicators that are targeted to different cellular compartments have provided a platform for live cell confocal imaging of cellular Ca2+ signals. Here we describe instructions for the use of two Ca2+ detection systems: aequorin based FAS (film adhesive seedlings) luminescence Ca2+ imaging and case12 based live cell confocal fluorescence Ca2+ imaging. Luminescence imaging using the FAS system provides a simple, robust and sensitive detection of spatial and temporal Ca2+ signals at the tissue level, while live cell confocal imaging using Case12 provides simultaneous detection of cytosolic and nuclear Ca2+ signals at a high resolution.

Measuring Spatial and Temporal Ca2+ Signals in Arabidopsis Plants

Ca2+ signaling regulates diverse biological processes in plants. Here we present approaches for monitoring abiotic stress induced spatial and temporal Ca2+ signals in Arabidopsis cells and tissues using the genetically encoded Ca2+ indicators Aequorin or Case12.

時空のCaを測定する<sup&gt; 2 +</supシロイヌナズナ植物における&gt;シグナル

Developmental and environmental cues induce Ca2+ fluctuations in plant cells. Stimulus-specific spatial-temporal Ca2+ patterns are sensed by cellular Ca2+ ...

Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of transporters. The phosphorylation and nucleotide dependent chloride channel activity of CFTR has been frequently studied in whole cell systems and as single channels in excised membrane patches. Many Cystic Fibrosis-causing mutations have been shown to alter this activity. While a small number of purification protocols have been published, a fast reconstitution method that retains channel activity and a suitable method for studying population channel activity in a purified system have been lacking. Here rapid methods are described for purification and functional reconstitution of the full-length CFTR protein into proteoliposomes of defined lipid composition that retains activity as a regulated halide channel. This reconstitution method together with a novel flux-based assay of channel activity is a suitable system for studying the population channel properties of wild type CFTR and the disease-causing mutants F508del- and G551D-CFTR. Specifically, the method has utility in studying the direct effects of phosphorylation, nucleotides and small molecules such as potentiators and inhibitors on CFTR channel activity. The methods are also amenable to the study of other membrane channels/transporters for anionic substrates.

Described here is a rapid and effective procedure for functional reconstitution of purified wild-type and mutant CFTR protein that preserves activity for this chloride channel, which is defective in Cystic Fibrosis. Iodide efflux from reconstituted proteoliposomes mediated by CFTR allows studies of channel activity and the effects of small molecules.

精製された野生型および変異型CFTRタンパク質の機能的再構成とチャネル活性の測定

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of ...

Validation of a Mouse Model to Disrupt LINC Complexes in a Cell-specific Manner

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the Nucleoskeleton and Cytoskeleton (LINC complexes). These protein scaffolds span the nuclear envelope and connect the interior of the nucleus to components of the surrounding cytoplasmic cytoskeleton. LINC complexes consist of two evolutionary-conserved protein families, Sun proteins and Nesprins that harbor C-terminal molecular signature motifs called the SUN and KASH domains, respectively. Sun proteins are transmembrane proteins of the inner nuclear membrane whose N-terminal nucleoplasmic domain interacts with the nuclear lamina while their C-terminal SUN domains protrudes into the perinuclear space and interacts with the KASH domain of Nesprins. Canonical Nesprin isoforms have a variable sized N-terminus that projects into the cytoplasm and interacts with components of the cytoskeleton. This protocol describes the validation of a dominant-negative transgenic mouse strategy that disrupts endogenous SUN/KASH interactions in a cell-type specific manner. Our approach is based on the Cre/Lox system that bypasses many drawbacks such as perinatal lethality and cell nonautonomous phenotypes that are associated with germline models of LINC complex inactivation. For this reason, this model provides a useful tool to understand the role of LINC complexes during development and homeostasis in a wide array of tissues.

Nuclear envelope proteins play a central role in many basic biological processes and have been implicated in a variety of human diseases. This protocol describes a new Cre/Lox-based mouse model that allows for the spatiotemporal control of LINC complexes disruption.

細胞特異的にLINC複合体を破壊するマウスモデルの検証

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the ...

Establishment of a Clonal Culture of Unicellular Conjugating Algae

It is essential to establish clonal cultures of microalgae for use in studies of various topics, such as physiology, genetics, taxonomy, and microbiology. Thus, it is extremely important to develop techniques to establish clonal cultures. In this article, we demonstrate the establishment of clonal cultures of a conjugating alga. Water samples are collected from the field. Subsequently, cells are isolated using a glass capillary pipette, placed in media, and grown under conditions suitable for generating a clonal culture.

In this article, we demonstrate the establishment of clonal cultures of unicellular conjugating algal species collected from a natural field site.

抱合の単細胞藻類の栄養文化の確立

It is essential to establish clonal cultures of microalgae for use in studies of various topics, such as physiology, genetics, taxonomy, and microbiology. ...