This work was supported by the European research council by a ERC starting/consolidator grant to RC and by the Dutch Foundation for research on matter (FOM) via a FOM program (10TM01).

ホウレンソウの葉から1全顔料の抽出<ol><li> 20秒間、ブレンダーを使用します（ 表1を参照）、コールド研削バッファー100mlにホウレンソウの葉（〜20グラム）の一方の握りをホモジナイズする。 </li><li> 4℃で10分間1500×gで20ミクロン遠心濾液の孔径を有するナイロン布の二つの層を通して溶液を濾過する。 </li><li>ソフトアーティストは冷たい洗浄バッファー（ 表1参照）1ml中にブラシをペイントして葉緑体を含むペレットを再懸濁します。ペレットを再懸濁した後、4℃で10分間、10,000×gで遠心洗浄緩衝液50mlの溶液を加える。 </li><li>上清を除去し、穏やかに（ 表1参照）の洗浄緩衝液50ml中にペレット（チラコイド）を懸濁します。 </li><li>遠心分離し、4℃で10分間、10,000×gで解決し、完全に上清を除去。この時点で、顔料の酸化を避けるために、暗闇の中で、以下のステップを実行する。 </李&gt; <li>色素を抽出する（ 表1参照）〜のNa 2 CO 3で緩衝し、80％アセトン20mlを加える。時折ボルテックス、10分間氷上で解決策をしておきます。 </li><li> 4℃で15分間12,000×gでの遠心分離により細胞成分のペレット。 NOTE：顔料が完全に抽出されない場合は、ペレットが緑色を有しており、1.6を繰り返すべきであるステップう。 </li><li>分液ロートに上清を収集します。ジエチルエーテルの0.4ボリュームを追加し、激しく振り、ガスを排出するためのバルブを開きます。 </li><li> 0.33 M NaClを0.8ボリュームを追加し、激しく混ぜる。層を分離するための〜10分を許可します。上部のエーテル相を抽出顔料が含まれています。明確な下相を除去します。 注：分離が明確でない場合、相分離を改善するための解決策を凍結し、解凍。 </li><li>適切なガラス容器に分液ロートの上から注ぐことによって、エーテルを除去します。グランのスプーンを追加することでドライウラル無水硫酸ナトリウム。溶液を旋回し、エーテルから水分を吸収する乾燥剤のために約5分を可能にする。 注：硫酸ナトリウムが完全に一緒に凝集しているような場合は、この手順を繰り返します。エーテルを十分に乾燥したとき、いくつかのフリーフローティングの結晶があるはずです。水層を形成した場合、追加の無水硫酸ナトリウムを添加する前に、パスツールピペットでこれを削除してください。 </li><li>背後に固体硫酸ナトリウムを残し、新しいガラス容器にエーテルをデカント。 </li><li>ロータリースピードバックでまたはN 2気流下でエーテルを蒸発。 </li><li> 100％のアセトン10mlに完全に色素を溶解する。 </li><li> 80％アセトン1ml中に少量（〜3μl）を希釈し、吸収スペクトルを測定し、クロロフィルa / bの比とPorra らによって記載された方法とクロロフィル濃度を決定する。 （1989）15。 </li><li>アセトンになるまで一定分量を、ロータリースピードバック中またはN 2気流下で顔料を乾燥完全に蒸発。 -80℃で乾燥した顔料を格納します。 </li></ol>ホウレンソウからカロテノイドの2の抽出<ol><li> 、手順1.1〜1.5に従ってください。この時点で、顔料の酸化を避けるために、暗闇の中で、以下のステップを実行する。 </li><li>色素を抽出する（ 表1参照）のNa 2 CO 3で緩衝〜50ミリリットルの96％エタノール中にチラコイドペレットを再懸濁する。 5分間氷上で解決策をしておきます。 </li><li> 4℃で15分間12,000×gでの遠心分離により細胞成分のペレット。 NOTE：顔料が完全に抽出されない場合は、ペレットが緑色を有しており、2.2を繰り返すべきであるステップう。 </li><li>上清を収集し、（w / v）のケン化を開始するために80％のKOH 0.1ボリュームを追加。 </li><li> 4℃のCO / Nで溶液のままにし、しっかりと蓋をし、光から保護。 </li><li>分液ロートに溶液を収集します。ジエチルエーテルの1ボリュームを追加し、穏やかに混合。 </li><li> 0.8巻を追加0.33 M NaClをリューム、穏やかに混合。層を分離するための〜10分を許可します。上部のオレンジ色のエーテル相をケン化カロテノイドが含まれています。漏斗のストップコックを介して排出することによって、グリーン下相を除去します。 </li><li>水3容量を追加し、水酸化カリウムを除去するために穏やかに混合。層を分離することを許可する。注：上相が濁って表示された場合は、塩化ナトリウム（溶液200ml中のNaClの例、3グラム）を少量添加し、溶解するために穏やかに旋回。 </li><li>漏斗のストップコックを介して排出することによって下相を除去します。 </li><li> 、手順1.13に1.10に従ってください。 </li><li> 80％アセトン1ml中に少量（〜3μl）を希釈し、80％アセトン中で440 nmでの吸収スペクトルを測定する。濃度を決定するために、カロテノイドの平均係数絶滅を使用し、以下の式16（440 = 255ε）：カー[mg / mlの] =（ABS 440nmで / 225）×11（光路）= 1センチメートル。 </li><li> carotenoiを分注し、乾燥スピードバック中またはN 2気流下dsはすべてジエチルエーテルが蒸発されるまで。 -80℃で乾燥した顔料を格納します。 </li></ol> クラミドモナスから3全顔料とカロテノイドの抽出<ol><li> C.を育てる表面に液体培養の少量を広げることにより、シャーレ中の固体TAP培地17上のクラミドモナス 。細胞の緑色の層が表示されるまで20マイクロモルの写真の連続照明フラックスのPSAメートル-2秒-1の下で成長する。 </li><li>無菌接種ループを用いて、C.少量の収穫固体TAP培地からクラミドモナスとを1Lフラスコ中でTAP培地17 500ml中に細胞を置く。 20マイクロモルの写真の連続照明フラックスのPSAメートル-2秒-1の下で170rpmで攪拌しながら25℃で文化を育てる。 </li><li> 5-6日後、培養液を対数期（6×10 6細胞/ mlでの最後に到達する必要がありまたは750 nmで2〜2.5の光学密度）。遠心し、4℃で15分間、4,000×gで文化。 </li><li>全顔料抽出には、ステップ1.15に1.6に従ってください。 </li><li>全顔料抽出物の収率は、Cの完全な増殖培養の500ミリリットルから始まるクラミドモナスは、0.5mgのCHL a + b の / mlの濃度で遊ん5ミリリットルの溶液である。 </li><li>カロテノイドの抽出のために、ステップ2.12に2.2に従ってください。 </li></ol>封入体の精製4。 <ol><li>標準的な分子生物学的手順を用いて融合したC末端Hisタグをもたらす発現ベクターに目的のLHCタンパク質のコード配列をクローニングする。 E.に、この構築物を変換するそのようなBL21（DE3）などの大腸菌宿主株。 </li><li>準備溶解緩衝液、洗剤緩衝液、トリトン緩衝液、TE（ 表1）、1 Mイソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド（IPTG）および適切な抗生物質を含むLB培地18。 </li><li> SINGLピック電子E.標準的な手順6を用いて、適切な抗生物質を含むLB培地約5中へ新たに画線し、プレートからの発現クローンを含む大腸菌コロニー 。少なくとも16時間、220rpmで攪拌​​しながら37℃で成長させる。 </li><li> LBの250ミリリットルと1リットルの三角フラスコに、O / N培養の2.5ミリリットルを追加し、適切な抗生物質を補充した。 </li><li> （OD 600が 〜0.6になるまで、または）、220rpmで、37℃で2〜3時間細胞を成長させる。 </li><li> 1 mMの最終濃度までIPTGを追加します。 220rpmで3〜4時間、37℃で細胞を増殖し続ける。 </li><li>予め秤量した遠心管中、4℃で5000×gで10分間の文化を遠心します。徹底的に上澄みを捨て、再び計量し、遠心管の重量を差し引くことにより、重量のペレットを決定。 </li><li> E.を再懸濁0.8ミリリットル/激しいボルテックスによる溶解バッファーのg中の大腸菌細胞ペレット。 注：あるいは、細胞ペレットを-80℃で凍結することができ後で使用するためのC。凍結したペレットで始まる場合は、溶解バッファーを追加する前に、完全に解凍することができます。 </li><li>細胞1グラム当たりのリゾチーム2mgを追加し、30分間、時折ボルテックスで濡れた氷上でインキュベートする。 </li><li> 20μg/ mlのDNA分解酵素、10mMのMgCl 2、1のNaCl、20μg/ mlのRNA分解酵素を追加します。ボルテックスし、30分間氷上に置く。 </li><li>細胞1グラムあたりの冷洗剤緩衝液2mlを加える。よく混合し、5分間、室温を保つ。 </li><li> 2ミリリットルの遠心管への転送は、（必要に応じて2のチューブに分割）。 4℃で12,000×gで10分間遠心分離し、封入体をペレット化する。 </li><li>冷たいトリトン緩衝液1mlを加え、完全に超音波処理することによりペレットを再懸濁し（20秒間隔で3パルス×5秒×50％出力）。注：超音波処理の間、寒さを保つために氷水に囲まれた小さなビーカーにチューブを持っている。複数のチューブの場合には、再懸濁した後に1チューブに再懸濁し、封入体を兼ね備えています。 </li><li> 12,000で10分間遠心分離4℃での遠心は、封入体をペレット化する。 </li><li>繰り返し手順4.13と4.14の2倍。 </li><li> Tritonバッファーを除去するための最終洗浄のために超音波処理を使用してコールドTE 1ml中封入体を再懸濁します。 4℃で12,000×gで10分間遠心分離し、封入体をペレット化する。 </li><li>超音波処理による風邪のTE 1ml中にペレットを再懸濁。 </li><li>そのようなブラッドフォードアッセイ19などの標準的な方法によってタンパク質濃度を評価する。 -20℃で封入体のストア分量。 </li></ol> 5。再構成吸光度はQyは地域（600〜750ナノメートル）で測定されている場合、このプロトコルは、典型的には4のODで再構成したタンパク質1〜2mlのが得られます。注意を手術中に適切な比率を維持するように注意すべきである量は、所望のように調節することができる。 <ol><li> 2X再構成緩衝液、20％OG、2 MのKCl、TE： 表1に記載したように、以下の溶液を調製する。以下のを実行します薄暗い光の中でTEPS。 </li><li> 2ミリリットルの微量遠心管中で400μlのTEの合計LHC封入体の800μgの再懸濁する。 2倍の再構成バッファと渦簡単に400μlのを追加します。 </li><li> 10 mMの最終濃度が、β-メルカプトエタノール（株式14.8 M）0.6を添加する。 98℃で1分間、タンパク質を加熱する。 3分間室温でボルテックス簡潔にと場所。 </li><li>精力的に1-2分間入浴ソニケーターで1分間、または場所をボルテックスすることによって30μlの100％エタノールの総乾燥したクロロフィル色素の500μgのプラス80μgのカロテノイド色素を懸濁します。 </li><li> 4℃で15,800×gで〜30秒顔料ミックスをスピンしてないペレットがないことを確認してください。ペレットがある場合は、ボルテ​​ックスおよび/または超音波処理を繰り返します。重要：再懸濁し、スピンした後、すぐにタンパク質に顔料を追加したり、それを集約することができますし、再び再懸濁する必要があります。 </li><li>ボルテックスしながらゆっくりと冷却してタンパク質に顔料ミックスを追加します。ボルテックス5-10 sに進みますECおよび湿った氷上にチューブを配置すること。タンパク質がチューブの上部をオーバーフローすることができますようにあまりにも積極的にボルテックスしないように注意してください。 </li><li> 、20％のオクチルβ-D-グルコピラノシド（OG）（最終濃度2％）の94μl加え簡単にボルテックスし、氷上で10分間保つ。 </li><li> 、塩化カリウム2 M（最終濃度150〜200 mM）を90μl加え手短にボルテックスし、氷上で20分間続ける。注：カラム調製（第6節）は、この時点で開始することができます。 </li><li> 4℃で15,800×gで10分間スピン。 10ミリリットルチューブに（LDS沈殿した）ペレットを乱すことなく、上清を取り除きます。寒さと、光から保護してください。 </li></ol> 6。ニッケルカラム精製<ol><li> OG緩衝液、OGリンス緩衝液、溶出バッファー： 表1に記載したように、以下の溶液を調製する。 </li><li>空気が、このステップと次のステップの間に、列の中に入っていないことを確実にする蠕動ポンプにニッケルセファロースカラム（1ミリリットル）または同等を接続します。 </li><li> Tの速度を設定します彼は1ミリリットル/分にポンプおよびストレージ·ソリューションを除去するために水5〜10mlのカラムをすすいでください。 </li><li> OGバッファ3-4 mlのカラムを平衡化する。 </li><li>カラムにタンパク質試料負荷にOGバッファ3-4 mlを加え。注記：タンパク質はLDSの除去後10分よりも長い間、氷上で座っている場合には、追加のLDS沈殿を除去するために1分間、4℃で15,800×gで再度スピン。 </li><li> OG緩衝液5mlでカラムを洗浄します。 </li><li> OGリンス緩衝液2mlでカラムを洗浄します。 </li><li> 3ミリリットルの溶出バッファーで結合したタンパク質を溶出。再構成されたタンパク質が含まれている緑色の溶出を収集します。注：これは通常、合計で約1ミリリットルである。 </li></ol> 7。スクロース勾配遠心<ol><li>ショ糖溶液、0.06％のβ-DM、0.01MのHEPES、pH7.6の表1に記載したように、以下の溶液を調製する。 </li><li>ショ糖溶液を用いて超遠心管を記入し、CO / N O -20℃で凍結rは-80°Cのために少なくとも1時間。 </li><li>冷凍庫からチューブを外し、4℃で邪魔されずに解凍することができます。注：凍結/解凍工程は、0.1〜1Mのスクロース勾配を作成します。 15mlチューブは、典型的には約3時間で解凍。 </li><li>慎重にステップ6.8のニッケルセファロースカラムから溶出された緑色の画分として、上から同じボリュームを削除します。その後、勾配を乱さないようにゆっくりと上に再構成されたサンプルをロードします。 </li><li>加速とブレーキなしで停止を遅らせるように設定18時間SW-41またはSW-60スウィングローターを使用して、超遠心分離機内のバランス管4℃200,000×gでスピン。 </li><li>慎重にピンセットでチューブホルダの勾配を取り出します。トップからの画分を収集する鈍い開口部を有する長い針と注射器を使用してください。注：別の方法として、針でチューブを穿刺し、滴を収集することにより、下からの画分を収集します。 </li></ol>

The authors declare no conflict of interest

膜タンパク質は勉強するのは簡単ではありません。天然の膜タンパク質の単離は、タンパク質を損傷し、必須の補因子を除去することができる界面活性剤と脂質二重層を可溶化する必要性によって複雑になる。これらのタンパク質は、集光性複合体の場合のように、それは、単一の複合体の精製が困難になる、また、生体膜において低レベルで存在するかもしれない、または密接に関連するタンパク質と混合する。 E.における異種タンパク質の発現大腸菌およびインビトロでの再構成中 これらの問題を回避する可能性を提供する。従ってネイティブ複合体20,21,23とのものと非常に類似した特性を有する複合体におけるインビトロ再構成および折り畳まれたタンパク質の精製の ​​結果が均質24にまで精製することができない複合体を研究するために使用することができ- 27。 この方法は簡単にattainabさほうれん草を使用しています全顔料及​​びカロテノイド調製物のためのソースとしてル一年中、。藻類に対する天然のタンパク質のいくつかの再構成のために、藻類から精製された顔料の使用は、異なる顔料組成物に好適である。クロロフィルa / bの比およびクロロフィル/車比に関係なく、顔料ソースの同じままである。 これは、再構成の効率は通常約35％で28であることを認識することが重要です。したがって、再構成後の溶液から非結合顔料および折り畳まれていないアポタンパク質を除去することが必要である。二段階精製プロトコルは、（また結果を参照）、このプロトコルで提示される。しかし、ショ糖勾配ステップはアポとホロタンパク質の完全な分離を可能にしないことに留意すべきである。アポタンパク質は、機能的測定を妨害しない、したがって顔料を含有しない限り、ほとんどの分析のため、これは問題ではない。しかし、ケースでは、完全に、FRからアポタンパク質を除去することが必要である再構成された複合体（例えば、タンパク質の化学量論に顔料を計算する）を含有するアクションは、陰イオン交換カラムは、（参照Passarini ら詳細については2009年）を使用することができる。 試験管内で孤立した顔料を用いて、組換え集光タンパク質をリフォールディングする能力は、それによって得られた複合体の特性を変化させる、さまざまな方法で再構成「環境」を変更することにより、複合体を「操る」する機会を提供する。例えば、再構成中の顔料組成物を変更すると、変更された顔料組成物との複合体をもたらすことができる。この機能は、各種顔料を複合体の構造および安定性に及ぼす影響を調べるために利用することができる。 1と2.9のクロロフィル/車比：1通常ホウレンソウから得られた顔料調製物は、3のクロロフィルa / bの比を有する。この比率は、一般的にn個と同じ性質を用いて再構成タンパク質を産生する1をative。 33 -しかし、精製されたクロロフィルAまたはBの添加によりクロロフィルa / bの比の調整は、結合部位30の選択性を変化させることに起因する異なる顔料の結合に影響を与えることができる。顔料の結合部位の大部分はクロロフィルa またはクロロフィルbのための完全に選択的ではないが、異なる親和性10,30,34であるが、両方を収容することができるので可能である。 38 -同様に、カロテノイド結合部位はまた、複数のキサントフィル種8,35に対応できることが示された。 CP26、各種の顔料組成物を用いて、高等植物、他の色素-タンパク質複合体の別の再構成は、 表2 39に示されている。これらの再構成は、特定の顔料39の結合部位の親和性を評価した。これは、同じ顔料cを有する複合体を得るために、ことに留意することが興味深い。1：ネイティブ一つとしてompositionは、顔料ミックスのクロロフィルa / bの比は3でなければなりません。これは高等植物20,40のすべてのLHC複合体のためのケースであると思われる。 再構成技術を用いて、分子生物学の組み合わせがクロロフィル結合複合体の性質をより詳細に研究することができます。 44 -異なるタンパク質複合体の安定性及び折り畳みドメイン、またはタンパク質-タンパク質相互作用への関与の重要性は、アポタンパク質を切り捨てる又はランダム突然変異誘発8,41を実行することによって決定されている。 52 -異なる顔料の調整のための重要な単一のアミノ酸残基は、個別の顔料の特性を分析したり、複雑な10,28,29,45の機能および安定性への寄与を評価するために、部位特異的変異誘発によって変更することができる。 図6ははと​​Lhcb4（CP29）を再構成した位置216 53位のヒスチジンの変異。野生型および突然変異体複合体の顔料組成物の比較は、変異が標的部位は、WT複合体中のクロロフィルa を収容することを示す、分子1クロロフィルの喪失を誘導することを示す。 WTおよび変異体の吸収スペクトルの違いは、顔料の含有量に対して正規化の際に、また、失われた顔料の吸収特性を示している。この場合、差はクロロフィルHis216によってコーディネートこの波長で吸収する（この変異体についての詳細は、分光特性がモッツォら 、2008年53参照 ）ことを示し、680nmでの主ピークに見ることができる。変異分析はまた、顔料54の分光特性に及ぼす環境の影響を決定するために用いることができる。 結論として、集光性タンパク質は、容易に顔料proteiその結果、in vitroで再構成することができる天然の複合体と非常に類似した特性を有するn複合体。また、さらなる研究のために高い収率および純度でタンパク質調製物を提供しながらこのように、天然のタンパク質を単離することの困難さは、排除される。 3の重要性：本物の複合体の製造における1クロロフィルa / bの比が強調され、再構成された野生型および変異LHCsの実施例は、技術の応用を説明するために提供される。

植物や藻類の光合成装置は、膜内在性（CHL a）のクロロフィル a を結合するタンパク質、B（クロロフィルb）およびカロテノイド（車）が挙げられる。これらの色素-タンパク質複合体は、収穫光エネルギーで活性であり、それが電荷分離2を促進するために使用される反応中心にその励起エネルギーを伝達する。それらはまた、高い光損傷3,4から光合成装置を保護調節フィードバック機構に関与している。集光複 ​​合体（LHCs）は植物や藻類5の関連タンパク質の大きなファミリーで構成されている。 ファミリーの各メンバーの均質な精製は、複合体の高度に類似の化学的及び物理的性質によって複雑化されている。また、精製手順は、しばしば、顔料または脂質などの他の潜在的な補因子の損失をもたらす。 インビトロ再構成representsは強力な方法は、これらの問題を克服する。光化学系II（LHC-II）に関連付けられているLHCは、最初1987年1 Plumleyとシュミットによってin vitroで再構成された。研究者は、植物の葉緑体とは別に脱脂タンパク質及び顔料を抽出した後、リチウムの存在下での顔料と熱変性タンパク質を組み合わせた凍結融解1の3つのサイクルが続くドデシル硫酸（LDS）、。これらは、再構成されたLHC複合体のスペクトル特性は、植物から精製された複合体と非常に類似していたことを示した。何らかの固有の自己組織化機能への可能性が高いLHC顔料 - タンパク質複合体を再構成の容易さは、生物から精製された複合体を単離することが困難であるとともに、他の研究者による方法の迅速な採択につながった。 大腸菌（E. coli）で過剰発現光合成タンパク質の再構成1990年6ポールセンらによって達成された。E.で大腸菌は、過剰発現した膜タンパク質は、典型的には、その設備のそれらの精製、封入体に含まれている。再構成は、タンパク質の折り畳みを開始する顔料を添加したLDSの存在下で組換えタンパク質を含有する封入体の熱変性によって達成される。 LHCII複合体の折り畳みは、2段階のプロセスである：まず、 クロロフィル a が 1分以内に結合している;第二、 クロロフィル b は、数分7かけ結合し、安定化される。 フォールディング動力学への洞察を提供することに加えて、部位特異的突然変異誘発と組み合わせたインビトロでの再構成において安定性（ 例えば、8,9）または顔料の調整（ 例えば、10）に特異的なアミノ酸の同定が重要で可能にした。そのような顔料組成物または洗剤のようなパラメータを調整することによってリフォールディング条件の操作はまた、要素criticaを同定したそのようなLHCIIコンプレックスのキサントフィルの要件として適切な折り畳みのためのL（ 例えば、1,11）。さらに、複合体に結合された個別の顔料の特性の調査は生体内で再構成された複合体を使用可能であった（ 例えば、10）。 ここで説明する方法は、ほうれん草と緑藻クラミドモナスから色素（クロロフィルやカロテノイド）を単離することから始まる。EからLHCのタンパク質の発現および精製封入体の形で大腸菌を LHCとNiアフィニティーカラムによるその後の精製の ​​再構成に続いて、次に詳細に説明する。最後のステップでは、再構成された複合体はさらに自由顔料および折り畳まれていないアポタンパク質を除去するために、スクロース勾配遠心分離により精製される。このプロトコルは、以上の異なる研究所によって導入されたいくつかの変更を組み込んだ最適化された手順を示して時間1,6,10,12 -14。

<table><tbody><tr><td>HisTrap HP</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5247-01</td><td></td></tr><tr><td>Nylon cloth&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>20 &amp;mu;m pores</td></tr><tr><td>Soft artists paint brush&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NONIDET P-40</td><td>Sigma</td><td>74385</td><td></td></tr><tr><td>Beta-DM</td><td>Sigma</td><td>D4641</td><td></td></tr><tr><td>DNAase</td><td>ThermoScientific</td><td>EN0525</td><td></td></tr><tr><td>Milk Powders</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNAase</td><td>ThermoScientific</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Octyl &amp;beta;-D-glucopyranoside</td><td>Sigma</td><td>O8001&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuge XL</td><td>Beckman-Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TAP medium</td><td></td><td></td><td>see reference 17</td></tr><tr><td>LB medium</td><td></td><td></td><td>see reference 19</td></tr></tbody></table>

in vitro reconstitution of light-harvesting complexes of plants and green algae

植物および緑藻類では、光は光捕集複合体（LHCs）、クロロフィルおよびカロテノイド座標内在性膜タンパク質のファミリーによって捕捉される。 インビボでは 、これらのタンパク質はチラコイド膜に挿入されている複合体を形成する顔料を用いて折り畳まれる葉緑体の。ファミリーのメンバーの化学的および物理的特性の高い類似性は、一緒に彼らは簡単に単離中の顔料を失う可能性があるという事実と、天然の状態での精製が困難なことができます。 LHCsの均質な調製物を得るための別のアプローチは、それが天然のものと非常に類似した特性を有する複合体が得られる、精製された顔料および折り畳まれていないアポタンパク質から出発して、インビトロでこれらの複合体を再構成することが可能であったことを示した1987年1 Plumleyシュミットによって開発された複合体。これは、in vitro細菌発現された組換えタンパク質の使用への道を開い</eM&gt;再構成。再構成方法は、さまざまな理由で強力である：（1）個別の複合体の純粋な調製物を得ることができる、（2）顔料組成物は、構造と機能するようにそれらの寄与を評価するように制御することができる、（3）組換えタンパク質は、機能を研究するために突然変異させることができる個別の残基（ 例えば、顔料結合部位）、またはタンパク質ドメイン（ 例えば、タンパク質-タンパク質相互作用、フォールディング）の役割。この方法は、いくつかの研究室で最適と光捕集複合体の大部分に適用されている。ここに記載されているプロトコルは、現在、私たちの研究室で使用されるin vitroでの集光性複合体を再構成する方法を詳述 および方法の用途を説明する実施例を提供する。

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In Vitro Reconstitution of Light-harvesting Complexes of Plants and Green Algae

This protocol details the reconstitution of light-harvesting complexes in vitro. These integral membrane proteins coordinate chlorophylls and carotenoids and are responsible for harvesting light in higher plants and green algae.

植物や緑藻の光捕集複合体のin vitro再構成では、

In plants and green algae, light is captured by the light-harvesting complexes (LHCs), a family of integral membrane proteins that coordinate chlorophylls ...

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Research

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Biology

In Vitro Reconstitution of Light-harvesting Complexes of Plants and Green Algae

18.1K ビュー.  VU University Amsterdam. This protocol details the reconstitution of light-harvesting complexes in vitro. These integral membrane proteins coordinate chlorophylls and carotenoids and are responsible for harvesting light in higher plants and green algae.

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Water in Oil Emulsions: A New System for Assembling Water-soluble Chlorophyll-binding Proteins with Hydrophobic Pigments

Chlorophylls (Chls) and bacteriochlorophylls (BChls) are the primary cofactors that carry out photosynthetic light harvesting and electron transport. Their functionality critically depends on their specific organization within large and elaborate multisubunit transmembrane protein complexes. In order to understand at the molecular level how these complexes facilitate solar energy conversion, it is essential to understand protein-pigment, and pigment-pigment interactions, and their effect on excited dynamics. One way of gaining such understanding is by constructing and studying complexes of Chls with simple water-soluble recombinant proteins. However, incorporating the lipophilic Chls and BChls into water-soluble proteins is difficult. Moreover, there is no general method, which could be used for assembly of water-soluble proteins with hydrophobic pigments. Here, we demonstrate a simple and high throughput system based on water-in-oil emulsions, which enables assembly of water-soluble proteins with hydrophobic Chls. The new method was validated by assembling recombinant versions of the water-soluble chlorophyll binding protein of Brassicaceae plants (WSCP) with Chl a. We demonstrate the successful assembly of Chl a using crude lysates of WSCP expressing E. coli cell, which may be used for developing a genetic screen system for novel water-soluble Chl-binding proteins, and for studies of Chl-protein interactions and assembly processes.

This manuscript describes a simple and high-throughput method for assembling water-soluble proteins with hydrophobic pigments that is based on water-in-oil emulsions. We demonstrate the effectiveness of the method in the assembly of native chlorophylls with four variants of recombinant water-soluble-chlorophyll binding proteins (WSCPs) of Brassica plants expressed in E. coli.

油中水型エマルジョン：疎水性顔料と水溶性クロロフィル結合タンパク質を組み立てるための新しいシステム

Chlorophylls (Chls) and bacteriochlorophylls (BChls) are the primary cofactors that carry out photosynthetic light harvesting and electron transport. ...

化学

Isolating and Incorporating Light-Harvesting Antennas from Diatom Cyclotella Meneghiniana in Liposomes with Thylakoid Lipids

The photosynthetic performance of plants, algae and diatoms strongly depends on the fast and efficient regulation of the light harvesting and energy transfer processes in the thylakoid membrane of chloroplasts. The light harvesting antenna of diatoms, the so called fucoxanthin chlorophyll a/c binding proteins (FCP), are required for the light absorption and efficient transfer to the photosynthetic reaction centers as well as for photo-protection from excessive light. The switch between these two functions is a long-standing matter of research. Many of these studies have been carried out with FCP in detergent micelles. For interaction studies, the detergents have been removed, which led to an unspecific aggregation of FCP complexes. In this approach, it is hard to discriminate between artifacts and physiologically relevant data. Hence, more valuable information about FCP and other membrane bound light harvesting complexes can be obtained by studying protein-protein interactions, energy transfer and other spectroscopic features if they are embedded in their native lipid environment. The main advantage is that liposomes have a defined size and a defined lipid/protein ratio by which the extent of FCP clustering is controlled. Further, changes in the pH and ion composition that regulate light harvesting in vivo can easily be simulated. In comparison to the thylakoid membrane, the liposomes are more homogenous and less complex, which makes it easier to obtain and understand spectroscopic data. The protocol describes the procedure of FCP isolation and purification, liposome preparation, and incorporation of FCP into liposomes with natural lipid composition. Results from a typical application are given and discussed.

Isolating and Incorporating Light-Harvesting Antennas from Diatom Cyclotella Meneghiniana in Liposomes with Thylakoid Lipids

Here, we present a protocol to isolate fucoxanthin chlorophyll a/c binding proteins (FCP) from diatoms and incorporate them into liposomes with natural lipid compositions to study excitation energy transfer upon ion composition changes.

分離してチラコイド脂質リポソームの珪藻峰 Meneghinianaから光捕集アンテナを組み込む

The photosynthetic performance of plants, algae and diatoms strongly depends on the fast and efficient regulation of the light harvesting and energy ...

生化学

Isolation of Physiologically Active Thylakoids and Their Use in Energy-Dependent Protein Transport Assays

Chloroplasts are the organelles in green plants responsible for carrying out numerous essential metabolic pathways, most notably photosynthesis. Within the chloroplasts, the thylakoid membrane system houses all the photosynthetic pigments, reaction center complexes, and most of the electron carriers, and is responsible for light-dependent ATP synthesis. Over 90% of chloroplast proteins are encoded in the nucleus, translated in the cytosol, and subsequently imported into the chloroplast. Further protein transport into or across the thylakoid membrane utilizes one of four translocation pathways. Here, we describe a high-yield method for isolation of transport-competent thylakoids from peas (Pisum sativum), along with transport assays through the three energy-dependent cpTat, cpSec1, and cpSRP-mediated pathways. These methods enable experiments relating to thylakoid protein localization, transport energetics, and the mechanisms of protein translocation across biological membranes.

We present protocols herein for high-yield isolation of physiologically active thylakoids and protein transport assays for the chloroplast twin arginine translocation (cpTat), secretory (cpSec1), and signal recognition particle (cpSRP) pathways.

生理活性とエネルギー依存性タンパク質輸送アッセイでの使用の分離

Chloroplasts are the organelles in green plants responsible for carrying out numerous essential metabolic pathways, most notably photosynthesis. Within ...

Separation of Spinach Thylakoid Protein Complexes by Native Green Gel Electrophoresis and Band Characterization using Time-Correlated Single Photon Counting

The light reactions of photosynthesis are carried out by a series of pigmented protein complexes in the thylakoid membranes. The stoichiometry and organization of these complexes is highly dynamic on both long and short time scales due to processes that adapt photosynthesis to changing environmental conditions (i.e., non-photochemical quenching, state transitions, and the long-term response). Historically, these processes have been described spectroscopically in terms of changes in chlorophyll fluorescence, and spectroscopy remains a vital method for monitoring photosynthetic parameters. There are a limited number of ways in which the underlying protein complex dynamics can be visualized. Here we describe a fast and simple method for the high-resolution separation and visualization of thylakoid complexes, native green gel electrophoresis. This method is coupled with time-correlated single photon counting for detailed characterization of the chlorophyll fluorescence properties of bands separated on the green gel.

Here we present a protocol to separate solubilized thylakoid complexes by Native Green Gel electrophoresis. Green gel bands are subsequently characterized by Time Correlated Single Photon Counting (TCSPC) and basic steps for data analysis are provided.

Time-Correlated 単一光子のカウントを使用してネイティブ グリーン ゲル電気泳動とバンドによってほうれん草チラコイドのタンパク質複合体の分離

The light reactions of photosynthesis are carried out by a series of pigmented protein complexes in the thylakoid membranes. The stoichiometry and ...

環境学

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

Light mediates an array of developmental and adaptive processes throughout the life cycle of a plant. Plants utilize light-absorbing molecules called photoreceptors to sense and adapt to light. The red/far-red light-absorbing phytochrome photoreceptors have been studied extensively. Phytochromes exist as a family of proteins with distinct and overlapping functions in all higher plant systems in which they have been studied1. Phytochrome-mediated light responses, which range from seed germination through flowering and senescence, are often localized to specific plant tissues or organs2. Despite the discovery and elucidation of individual and redundant phytochrome functions through mutational analyses, conclusive reports on distinct sites of photoperception and the molecular mechanisms of localized pools of phytochromes that mediate spatial-specific phytochrome responses are limited. We designed experiments based on the hypotheses that specific sites of phytochrome photoperception regulate tissue- and organ-specific aspects of photomorphogenesis, and that localized phytochrome pools engage distinct subsets of downstream target genes in cell-to-cell signaling. We developed a biochemical approach to selectively reduce functional phytochromes in an organ- or tissue-specific manner within transgenic plants. Our studies are based on a bipartite enhancer-trap approach that results in transactivation of the expression of a gene under control of the Upstream Activation Sequence (UAS) element by the transcriptional activator GAL43. The biliverdin reductase (BVR) gene under the control of the UAS is silently maintained in the absence of GAL4 transactivation in the UAS-BVR parent4. Genetic crosses between a UAS-BVR transgenic line and a GAL4-GFP enhancer trap line result in specific expression of the BVR gene in cells marked by GFP expression4. BVR accumulation in Arabidopsis plants results in phytochrome chromophore deficiency in planta5-7. Thus, transgenic plants that we have produced exhibit GAL4-dependent activation of the BVR gene, resulting in the biochemical inactivation of phytochrome, as well as GAL4-dependent GFP expression. Photobiological and molecular genetic analyses of BVR transgenic lines are yielding insight into tissue- and organ-specific phytochrome-mediated responses that have been associated with corresponding sites of photoperception4, 7, 8. Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) of GFP-positive, enhancer-trap-induced BVR-expressing plant protoplasts coupled with cell-type-specific gene expression profiling through microarray analysis is being used to identify putative downstream target genes involved in mediating spatial-specific phytochrome responses. This research is expanding our understanding of sites of light perception, the mechanisms through which various tissues or organs cooperate in light-regulated plant growth and development, and advancing the molecular dissection of complex phytochrome-mediated cell-to-cell signaling cascades.

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

The molecular basis of spatial-specific phytochrome responses is being investigated using transgenic plants that exhibit tissue- and organ-specific phytochrome deficiencies. The isolation of specific cells exhibiting induced phytochrome chromophore depletion by Fluorescence-Activated Cell Sorting followed by microarray analyses is being utilized to identify genes involved in spatial-specific phytochrome responses.

でFACSアシスト細胞型特異的発現プロファイリングを使用して組織と器官特異フィトクロム応答を調査シロイヌナズナ</em

Light mediates an array of developmental and adaptive processes throughout the life cycle of a plant. Plants utilize light-absorbing molecules called ...

生物学

Purification of Active Photosystem I-Light Harvesting Complex I from Plant Tissues

This method is used to isolate Photosystem I (PSI) together with the Light Harvesting Complex I (LHCI), its native antenna, from plants. PSI-LHCI is a large membrane protein complex coordinating hundreds of light harvesting and electron transport factors and is the most efficient light harvesting system found in nature. Photons absorbed by the four LHCA antenna proteins that make up LHCI are transferred through excitonic interaction to the PSI core reaction center and are used to facilitate light-driven charge separation across the thylakoid membrane, providing reducing power and energy for carbon fixation in photoautotrophic organisms. The high quantum efficiency of PSI makes this complex an excellent model to study light-driven energy transfer. In this protocol, plant tissue is mechanically homogenized, and the chloroplasts are separated from the bulk cellular debris by filtration and centrifugation. The isolated chloroplasts are then osmotically lysed, and the thylakoid membranes are recovered via centrifugation and solubilized using the detergent n-dodecyl-beta-maltoside. The solubilized material is loaded onto an anion exchange column to collect most of the chlorophyll-containing complexes. Larger complexes are precipitated from the solution, resuspended in a small volume, and loaded on sucrose gradients to separate the major chlorophyll-containing complexes. The resulting sucrose gradient fractions are characterized to identify the band of interest containing PSI-LHCI. This protocol is highly similar to the protocol used in the crystallization of plant PSI-LHCI with some simplifications and relies on methods developed over the years in the lab of Nathan Nelson.

This protocol describes the isolation of Photosystem I (PSI) - Light Harvesting Complex I (LHCI) from plant tissues. PSI along with PSII is responsible for the conversion of light to chemical energy in oxygenic photoautotrophs and has a quantum efficiency of ~1, making it a target for studying light-driven energy transfer.

This method is used to isolate Photosystem I (PSI) together with the Light Harvesting Complex I (LHCI), its native antenna, from plants. PSI-LHCI is a ...

A New Approach for the Comparative Analysis of Multiprotein Complexes Based on 15N Metabolic Labeling and Quantitative Mass Spectrometry

The introduced protocol provides a tool for the analysis of multiprotein complexes in the thylakoid membrane, by revealing insights into complex composition under different conditions. In this protocol the approach is demonstrated by comparing the composition of the protein complex responsible for cyclic electron flow (CEF) in Chlamydomonas reinhardtii, isolated from genetically different strains. The procedure comprises the isolation of thylakoid membranes, followed by their separation into multiprotein complexes by sucrose density gradient centrifugation, SDS-PAGE, immunodetection and comparative, quantitative mass spectrometry (MS) based on differential metabolic labeling (14N/15N) of the analyzed strains. Detergent solubilized thylakoid membranes are loaded on sucrose density gradients at equal chlorophyll concentration. After ultracentrifugation, the gradients are separated into fractions, which are analyzed by mass-spectrometry based on equal volume. This approach allows the investigation of the composition within the gradient fractions and moreover to analyze the migration behavior of different proteins, especially focusing on ANR1, CAS, and PGRL1. Furthermore, this method is demonstrated by confirming the results with immunoblotting and additionally by supporting the findings from previous studies (the identification and PSI-dependent migration of proteins that were previously described to be part of the CEF-supercomplex such as PGRL1, FNR, and cyt f). Notably, this approach is applicable to address a broad range of questions for which this protocol can be adopted and e.g. used for comparative analyses of multiprotein complex composition isolated from distinct environmental conditions.

A New Approach for the Comparative Analysis of Multiprotein Complexes Based on 15N Metabolic Labeling and Quantitative Mass Spectrometry

The described comparative, quantitative proteomic approach aims at obtaining insights into the composition of multiprotein complexes&#160;under different conditions and is demonstrated by comparing genetically different strains. For quantitative analysis equal volumes of different fractions from a sucrose density gradient are mixed and analyzed by mass spectrometry.

に基づいた多タンパク質複合体の比較分析のための新たなアプローチ<sup&gt; 15</sup&gt; N代謝標識および定量的質量分析

The introduced protocol provides a tool for the analysis of multiprotein complexes in the thylakoid membrane, by revealing insights into complex ...

Protein-protein Interactions Visualized by Bimolecular Fluorescence Complementation in Tobacco Protoplasts and Leaves

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) is an in vivo method to monitor such interactions in plant cells. In the presented protocol the investigated candidate proteins are fused to complementary halves of fluorescent proteins and the respective constructs are introduced into plant cells via agrobacterium-mediated transformation. Subsequently, the proteins are transiently expressed in tobacco leaves and the restored fluorescent signals can be detected with a confocal laser scanning microscope in the intact cells. This allows not only visualization of the interaction itself, but also the subcellular localization of the protein complexes can be determined. For this purpose, marker genes containing a fluorescent tag can be coexpressed along with the BiFC constructs, thus visualizing cellular structures such as the endoplasmic reticulum, mitochondria, the Golgi apparatus or the plasma membrane. The fluorescent signal can be monitored either directly in epidermal leaf cells or in single protoplasts, which can be easily isolated from the transformed tobacco leaves. BiFC is ideally suited to study protein-protein interactions in their natural surroundings within the living cell. However, it has to be considered that the expression has to be driven by strong promoters and that the interaction partners are modified due to fusion of the relatively large fluorescence tags, which might interfere with the interaction mechanism. Nevertheless, BiFC is an excellent complementary approach to other commonly applied methods investigating protein-protein interactions, such as coimmunoprecipitation, in vitro pull-down assays or yeast-two-hybrid experiments.

Formation of protein complexes in vivo can be visualized by bimolecular fluorescence complementation. Interaction partners are fused to complementary parts of fluorescent tags and transiently expressed in tobacco leaves, resulting in a reconstituted fluorescent signal upon close proximity of the two proteins.

タバコプロトプラストと葉で二分子蛍光相補性によって可視化し、タンパク質間相互作用

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular ...

Studying the Supramolecular Organization of Photosynthetic Membranes within Freeze-fractured Leaf Tissues by Cryo-scanning Electron Microscopy

Cryo-scanning electron microscopy (SEM) of freeze-fractured samples allows investigation of biological structures at near native conditions. Here, we describe a technique for studying the supramolecular organization of photosynthetic (thylakoid) membranes within leaf samples. This is achieved by high-pressure freezing of leaf tissues, freeze-fracturing, double-layer coating and finally cryo-SEM imaging. Use of the double-layer coating method allows acquiring high magnification (&#62;100,000X) images with minimal beam damage to the frozen-hydrated samples as well as minimal charging effects. Using the described procedures we investigated the alterations in supramolecular distribution of photosystem and light-harvesting antenna protein complexes that take place during dehydration of the resurrection plant Craterostigma pumilum, in situ.

Here we describe a procedure for studying freeze-fractured plant tissues. High-pressure frozen leaf samples are freeze-fractured and double-layer coated, yielding well preserved frozen-hydrated samples that are imaged using the cryo-scanning electron microscope at high magnifications with minimal beam damage.

クライオ走査電子顕微鏡により凍結破砕葉組織内の光合成膜の超分子組織を学びます

Cryo-scanning electron microscopy (SEM) of freeze-fractured samples allows investigation of biological structures at near native conditions. Here, we ...

シロイヌナズナ実生のクロロフィル生合成の高分解能イメージング

Non-invasive Assay for Chlorophyll Biosynthesis Kinetics Determination during Early Stages of Arabidopsis De-etiolation

Chlorophyll biosynthesis is a hallmark of de-etiolation, one of the most dramatic stages in the plant life cycle. The tightly controlled and highly dynamic process of chlorophyll biosynthesis is triggered during the shift from the dark to the light in flowering plants. At the moment when etiolated seedlings are exposed to the first traces of sunlight, rapid (in order of seconds) conversion of protochlorophyllide into chlorophyllide is mediated by unique light-accepting protein complexes, leading via subsequent metabolic steps to the production of fully functional chlorophyll. Standard techniques for chlorophyll content analysis include pigment extraction from detached plant tissues, which does not apply to studying such fast processes. To investigate chlorophyll kinetics in vivo with high accuracy and spatiotemporal resolution in the first hours after light-induced de-etiolation, an instrument and protocol were developed. Here, we present a detailed procedure designed for statistically robust quantification of chlorophyll in the early stages of Arabidopsis de-etiolation.

著者スポットライト:脱エチオレーション中のクロロフィル合成の非侵襲的高分解能測定

Here, we describe an advanced tool designed for chlorophyll biosynthesis monitoring during the early stages of Arabidopsis seedling de-etiolation. The novel methodology provides non-invasive real-time chlorophyll fluorescence imaging at high spatial and temporal resolution.

シロイヌナズナ脱etiolationの初期段階におけるクロロフィル生合成速度測定のための非侵襲的アッセイ

Chlorophyll biosynthesis is a hallmark of de-etiolation, one of the most dramatic stages in the plant life cycle. The tightly controlled and highly ...

植物や緑藻の光捕集複合体のin vitro再構成では、

要約

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油中水型エマルジョン：疎水性顔料と水溶性クロロフィル結合タンパク質を組み立てるための新しいシステム

分離してチラコイド脂質リポソームの珪藻峰 Meneghinianaから光捕集アンテナを組み込む

生理活性とエネルギー依存性タンパク質輸送アッセイでの使用の分離

Time-Correlated 単一光子のカウントを使用してネイティブグリーンゲル電気泳動とバンドによってほうれん草チラコイドのタンパク質複合体の分離

でFACSアシスト細胞型特異的発現プロファイリングを使用して組織と器官特異フィトクロム応答を調査シロイヌナズナ

Purification of Active Photosystem I-Light Harvesting Complex I from Plant Tissues

に基づいた多タンパク質複合体の比較分析のための新たなアプローチ

タバコプロトプラストと葉で二分子蛍光相補性によって可視化し、タンパク質間相互作用

クライオ走査電子顕微鏡により凍結破砕葉組織内の光合成膜の超分子組織を学びます

シロイヌナズナ脱etiolationの初期段階におけるクロロフィル生合成速度測定のための非侵襲的アッセイ

植物や緑藻の光捕集複合体のin vitro再構成では、

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油中水型エマルジョン：疎水性顔料と水溶性クロロフィル結合タンパク質を組み立てるための新しいシステム

分離してチラコイド脂質リポソームの珪藻峰 Meneghinianaから光捕集アンテナを組み込む

生理活性とエネルギー依存性タンパク質輸送アッセイでの使用の分離

Time-Correlated 単一光子のカウントを使用してネイティブ グリーン ゲル電気泳動とバンドによってほうれん草チラコイドのタンパク質複合体の分離

でFACSアシスト細胞型特異的発現プロファイリングを使用して組織と器官特異フィトクロム応答を調査シロイヌナズナ

Purification of Active Photosystem I-Light Harvesting Complex I from Plant Tissues

に基づいた多タンパク質複合体の比較分析のための新たなアプローチ

タバコプロトプラストと葉で二分子蛍光相補性によって可視化し、タンパク質間相互作用

クライオ走査電子顕微鏡により凍結破砕葉組織内の光合成膜の超分子組織を学びます

シロイヌナズナ脱etiolationの初期段階におけるクロロフィル生合成速度測定のための非侵襲的アッセイ

Time-Correlated 単一光子のカウントを使用してネイティブグリーンゲル電気泳動とバンドによってほうれん草チラコイドのタンパク質複合体の分離