このプロトコルは、高解像度の染色体ループやその他の短距離相互作用機能を示すため、重要です。この技術の主な利点は、高いS/N比でヌクレオソーム分解能で3Dゲノム構成をマッピングできることです。MNase滴定を行うには、1×10のペレット1個を氷上で10分間解凍し、細胞を500マイクロリットルのDPBSに再懸濁し、細胞懸濁液を氷上で20分間インキュベートします。
室温で 5 分間 10 、 000 G で遠心分離して細胞を収集し、上清を除去します。ペレット化した細胞を500マイクロリットルのMB No.1バッファーに再懸濁します。1マイクロリットルのMNaseあたり20ユニットのバイアル1本を解凍し、本文に記載されている消化条件に合わせて10ミリモルトリスで希釈します。
10〜20秒の適切な時間間隔で、1マイクロリットルの最初のMNase消化溶液を4つのサンプルチューブの1つに加え、ボルテックスして、ThermoMixerで摂氏37度、800RPMで10分間インキュベートします。残りのMNase希釈液から1マイクロリットルを他の細胞アリコートに添加し続けます。新たに調製した200マイクロリットルの停止バッファーを、MNaseを添加したのと同じ順序で同じ時間間隔で各チューブに添加することにより、MNase消化を停止します。
摂氏65度で2時間インキュベートします。各サンプルに500マイクロリットルのPCIを加え、ボルテックスで十分に混合します。室温で19, 800 Gで5分間遠心分離し、相を分離します。
そして、水相を新しいチューブに移します。メーカーの指示に従って市販のDNA精製キットを使用してDNAを精製し、12マイクロリットルの溶出バッファーでサンプルを溶出します。精製したDNAサンプルに2〜5マイクロリットルのローディング色素を加えます。
1.5%アガロースゲルでサンプルを泳動し、実験に最適な消化度を選択します。最適な消化度は、サブヌクレオソーム断片がほとんどまたはまったくなく、モノとジヌクレオソームの比率が70〜90%です。この代表的なサンプルでは、レーン 3 と 4 の間の中間の消化度が追跡実験用に選択されました。
MNase滴定に基づいて、各サンプルアリコートに適切な量のMNaseを添加してクロマチンを消化します。よく混合し、ThermoMixerで摂氏37度、800RPMで10分間インキュベートします。各アリコートに1.6マイクロリットルの0.5モルEGTAを添加してMNase消化を停止し、ThermoMixerで摂氏65度で10分間、800 RPMの振とうでインキュベートします。
室温で 5 分間 10 、 000 G の遠心分離によりサンプルを収集し、上清を廃棄します。細胞ペレットを500マイクロリットルの1X NEBバッファー2.1に再懸濁します。10 の 5 倍の入力に相当するサンプルを 6 番目のセル以下にプールして、さらに処理します。
近接ライゲーションに進む前に、サンプルの 10% をインプットコントロールとして移し、MNase 消化レベルをモニターします。150マイクロリットルの10ミリモルトリス、25マイクロリットルの10%SDS、および25マイクロリットルの20ミリグラム/ミリリットルのプロテイナーゼKを消化コントロールに加え、摂氏65度で一晩インキュベートします。残りのサンプルを摂氏4度で5分間、10, 000 Gで遠心分離して回収し、上清を廃棄します。
ペレットを90マイクロリットルの新しく調製したMicro-Cマスターミックス1に再懸濁し、サーモミキサーで摂氏37度、800RPMで15分間インキュベートします。1マイクロリットルあたり5ユニットの10マイクロリットルのKlenowフラグメントを添加し、ThermoMixerでインキュベートします。次に、100マイクロリットルの新しく調製したMicro-Cマスターミックス2を加えます。
摂氏25度、800RPMで45分間インキュベートし、本文に記載されているようにEDTAで酵素反応をクエンチします。サーモミキサーで摂氏65度、800RPMで20分間インキュベートします。摂氏 4 度で 5 分間 10 、 000 G の遠心分離によりサンプルを採取し、上清を廃棄します。
サンプルを500マイクロリットルの新しく調製したMicro-Cマスターミックス3に再懸濁し、室温で15〜20RPMで2.5時間インキュベートします。遠心分離を繰り返し、上清を除去します。次に、サンプルを200マイクロリットルの新しく調製したMicro-Cマスターミックス4に再懸濁し、摂氏37度に設定したThermoMixerで800RPMで15分間インキュベートします。
逆架橋および脱タンパク質化のために、25マイクロリットルの20ミリグラム/マイクロリットルのプロテイナーゼKおよび25マイクロリットルの10%SDSをサンプルに加え、断続的な混合で摂氏65度で一晩インキュベートします。500マイクロリットルのPCIをサンプルとインプットコントロールに加え、ボルテックスで混合します。19, 800 Gで5分間遠心分離して相を分離し、上部の水相を新しいチューブに移します。
DNA を濃縮し、サンプルを 30 マイクロリットルに溶出し、インプットコントロールを 15 マイクロリットルに溶出します。1.5%アガロースゲルを流して、モノヌクレオソームとジヌクレオソームを分離します。ジヌクレオソームサイズのDNA断片を切除し、本文に記載されているようにDNAを抽出します。
150マイクロリットルのサンプルに150マイクロリットルの調製済みビーズを加え、室温でインキュベートします。チューブを適切な磁石に入れ、溶液が透明になるまで待ちます。上清を取り除き、ビーズを300マイクロリットルの1X TBWに再懸濁し、このステップを繰り返します。
磁気分離を繰り返し、溶液が透明になったら上清を除去し、ビーズを100マイクロリットルの0.1X TEに再懸濁します。繰り返し、50マイクロリットルの0.1X TEに再懸濁します。溶液をPCRチューブに移し、本文に記載されているようにDNA操作を行います。アダプターライゲーションが完了したら、サンプルを1X TBWで洗浄し、上清を廃棄し、ビーズを20マイクロリットルの0.1X TEに再懸濁します。PCRサイクル数を最適化し、本文に記載されているようにシーケンスライブラリを増幅します。反応ごとの250、000の細胞からのクロマチンはMNaseの4倍希釈されたと消化した。
最高濃度の10単位では、クロマチンの消化過多がほぼモノヌクレオソームDNAのみで構成されていました。250, 000 個のマウス ES 細胞と 0.625 単位の MNase の消化は、Micro-C 実験における分取消化の最も有望な出発点を提供しました。ただし、レーン 3 と 4 に示した条件の間の中間の MNase 濃度(100 万細胞あたり 5 単位に相当)を考慮する必要があります。
近接連結モノヌクレオソームバンドは、ジヌクレオソームと同様の約300塩基対のサイズを有していた。したがって、モノヌクレオソームとジヌクレオソームバンドのシグナル比は、主にモノヌクレオソームからジヌクレオソームにシフトしました。調製したシーケンシングライブラリの質と量は、最小限のPCRで評価しました。
可視化では、420塩基対で1つの明瞭なバンドが示され、アダプターダイマーのバンドはありませんでした。この研究のどちらのサンプルも高いマップ率を示しましたが、良好なサンプルはシスリードの割合が高かった。経染色体相互作用の割合が高い場合は、ランダムなライゲーションイベントを示しますが、一部の経染色体相互作用が重要である可能性があります。
さらに、良好なサンプルは、500塩基対未満の距離で、中程度の速度で順逆マッピング読み取りペアを示しました。これは、MNaseによって切断されないジヌクレオソームの割合が低く、2つの近接連結ヌクレオソームと同様のサイズであることを示しました。この実験では、適切なMNase消化度が重要です。
過剰に消化されたヌクレオソームは非効率的にライゲーションされ、消化が不十分なクロマチンには未消化のジヌクレオソームの大部分があり、シーケンシングライブラリを汚染する可能性があります。Micro-Cは、キャプチャーアプローチと組み合わせることで、遺伝子座特異的なゲノム構成を非常に高い解像度でマッピングすることができます。
