この方法は、CRISPRを促進する実験のためのガイドRNA発現プラスミドの作成を容易にすることを可能にする。この技術の主な利点は、クローニングを単一ステップで行うことができることと、シングルガイドRNA発現プラスミドを使用してペアガイドRNAを作成できることです。このプロトコルを開始するには、凍結乾燥したプライマーを1X TEバッファーで希釈し、最終濃度の100マイクロモルにします。
アリコートは、PCRストリップキャップチューブにフォワードとリバースプライマーの同量。混ぜる渦。次に、ガイドRNAオリゴヌクレオチド混合物をGの100倍で15秒間スピンダウンします。
ライゲーションを設定する前に、室温で5分間反応をインキュベートします。選択したPSB700ガイド発現ベクターの1~5マイクログラムを、ベクトル1マイクログラムあたり0.5マイクロリットルのBSNB1を使用してBSNB1に追加します。総容量が40マイクロリットルになるまで蒸留水を加え、摂氏55度で1時間消化を行います。
1.5%低融解アガロースゲルで消化製品を実行します。約9キロベースのフラグメントに対応する消化されたベクターバックボーンバンドを切り取ります。このゲルスライスを1.5ミリリットルマイクロ遠心分離チューブに移します。
市販のゲル精製キットを使用して、メーカーの指示に従ってアガロースゲルからDNAを抽出します。その後、DNAを10〜15マイクロリットルのTEバッファーに希釈し、濃縮されたエルテを得る。ライゲーションを行う準備ができたら、バイアルに15マイクロリットルの蒸留水を加えます。
以前にアニールされたガイドRNAオリゴヌクレオチドの1マイクロリットル、BSNB1消化PSB700ガイド発現ベクターの1マイクロリットル、10XT4 DNAリガーゼ反応バッファーの2マイクロリットルを加える。次に、ボルテックスで溶液を混合します。DNAリガーゼと渦の1マイクロリットルを再び追加します。
100倍Gで溶液を15秒間スピンダウンします。夜間に室温で反応をインキュベートし、アニールガイドRNAオリゴテ挿入物なしでBSNB1消化ベクター単独で無挿入陰性対照反応を含めないようにします。まず、マイナス80度の貯蔵から大腸菌を取り除き、氷の上で5〜10分間解凍します。
有能な大腸菌の8マイクロリットルに調製された反応混合物の0.5マイクロリットルを追加します。氷の上に30分間保持します。42°Cで45秒間加熱衝撃を与えます。
その後、混合物を2分間氷の上に置きます。ロータリーシェーカーを使用して、NEB DH5aまたはNEB厩舎に記載されている条件を使用して、SOC培地の250マイクロリットルの培養を回収してください。この後、適切な抗生物質耐性リソジニーブロスプレート上の培養物のプレート80マイクロリットル。
NEB DH5aの場合は摂氏37度、NEB厩舎では摂氏30度で一晩インキュベートします。まず、Phusion GC 特殊 PCR プロトコルを使用して、テキスト プロトコルで概説されている必要なフラグメントを作成します。このPCR製品を1%アガロースゲルで実行し、1つのバンドが約490塩基対で見られることを確認します。
このPCR産物をカットして抽出するゲル抽出キットを使用してください。次に、調製した1XマスターミックスをPCRチューブにアリコートする。マルチチャネルピペットを使用して、1マイクロリットル当たり40フェムトモレの濃度でPCR産物の1マイクロリットルを添加する。
PSB700ベクターの1マイクロリットルでは、マイクロリットル当たり40フェムトモレの濃度を追加します。ガイドRNAオリゴヌクレオチドの代わりに1マイクロリットルの水を用いることで無挿入制御を含む。テキストプロトコルで概説されているゴールデンゲートプロトコルを使用して、ベクトルを消化し、1つの反応で挿入物をリゲートします。
最初の黄金のゲート反応の後、各反応にBSNB1酵素の追加0.5マイクロリットルを加える。55°Cで1時間続けます。ゴールデンゲート反応が完了すると、前述の大腸菌変換プロセスに進みます。
本研究では、2つの方法を用いて、単一ガイドRNA発現ベクターが正常に作成されました。第1の方法では、ベクター骨格は、一連の短いオリゴヌクレオチドで予め消化され、結紮される。2番目の方法では、ゴールデンゲートクローニングを使用して、同時に単一の反応で消化し、リゲートしました。
ペアドガイドRNA発現ベクターは、それぞれ独自の独立プロモーターによって駆動され、カスタムPCRフラグメントをクローニングすることによって正常に作成される。これらの方法のいずれかでクローニングが成功すると、インサートコントロールプレートと比較して、適切な挿入DNAを用いた変換のための有意に多くのコロニーが出現する。この手順を試みる際は、複製手順に挿入コントロールを含めずに注意してください。
この手順に従って、エピゲノム工学のような他の方法は、クロマチンシグネチャが遺伝子発現にどのような影響を与えるかなどの質問に答えるために行うことができます。
