流体流のせん断応力は、骨細胞の機械刺激因子であると仮定されています。直接測定はできないため、骨細胞の共焦点画像から派生したモデルは、骨細胞樹状膜にかかる流体の流れのせん断応力を評価するための計算流体力学解析を行うための貴重なツールです。私たちの研究室で行われている研究の一部は、樹状突起の曲がりくねりや密度など、実際の骨細胞の裂孔の形態を骨や乳管網とともに使用して、流体の流れのせん断応力と応力が高くなる骨細胞樹状構造の位置を数値的に決定する分野での最近の開発に対応しています。
現在の技術には、最終要素解析、計算流体力学、流体構造相互作用、正確な3DモデルのためのX線や共焦点顕微鏡などの画像ベースのモデリング、制御荷重条件下でひずみなどの骨応答を測定するための機械的試験システムなど、さまざまな計算モデリングが含まれます。私たちの調査結果は、加齢や骨疾患による樹状突起の喪失が、骨が身体活動に反応しにくくなる要因であることを示しています。私たちは、骨細胞が樹状突起である高流体流せん断応力領域を通じて機械的負荷を検出すると予測しました。
また、流体の流れのせん断応力は、ラクナの形態、特に表面積と相関しています。このプロトコルの確立に伴い、私たちは現在、2つの異なる年齢と性別のマウス骨の骨細胞樹状突起における流体流せん断応力を研究するNIHプロジェクトに取り組んでいます。この研究は、老化と性差が負荷による骨の機械伝達にどのように影響するかを判断するのに役立ちます。
まず、マウスから採取した大腿骨をリン酸緩衝生理食塩水中の冷たい4%パラホルムアルデヒドに4°Cで24時間固定し、穏やかに揺らします。翌日、骨とリン酸緩衝生理食塩水をすすぎ、高速重合アクリルにすばやく埋め込みます。3番目の転子の上に300マイクロメートルの厚い横スライスをカットします。
サンドペーパーを使用して、骨切片を最終的な厚さ90〜100マイクロメートルに研磨します。次に、研磨された部分を70%95%と100%エタノールでそれぞれ5分間すすぎます。切片を1%fit Cで染色し、100%エタノールで4時間暗所で適度に振とうします。
次に、切片を100%エタノールで十分に洗浄します。そして、一晩風乾してから、スライドガラス上の封入剤に一滴入れます。試料にカバースリップを取り付けます。
共焦点顕微鏡で、励起用に488ナノメートルのレーザーをセットし、496〜596ナノメートルの発光収集ウィンドウを設定します。まず、5倍対物レンズを使用して骨部分全体の低電力画像をキャプチャします。次に、20x 対物レンズを使用して 3 つの関心領域の画像をキャプチャします。
1.7 のデジタル ズームと 0.126 マイクロメートルのステップ サイズを備えた 100x 1.44 の開口数式オイル対物レンズを使用して、1024 x 1024 ピクセルと 0.089 マイクロメートルのピクセル解像度で 400 の Z 平面の詳細な Z スタックを収集します。マウス骨細胞のコンピュータモデリングを行うには、マウス大腿骨のZスタック画像をTIFF形式でインポートした後、ImageJソフトウェアを開き、セクションメニューで閾値を調整して、マスクに含めるピクセル強度制限を変更します。クロップマスク操作を使用して、1つのラクナとその小管を対象領域としてクロップします。
ラクナを、一辺の長さが21、14、19マイクロメートルの架空の大きな立方体に包みます。領域拡大操作を実行して、接続されたピクセル領域を選択し、均一なラクナ-小管ネットワークまたは LCN を生成します。次に、計算された部品演算を使用して、ラクナ-小管マスクをオブジェクトに変換します。
スムージング操作を使用してLCNの量を減らし、骨細胞と樹状突起膜を構築します。次に、オブジェクトをエクスポートします。LCNと骨細胞樹状膜の2つの表面を1つの表面に結合します。
次に、リメッシュ操作を使用して、ラクナ小管空間の体積モデルを作成します。モデルをSTLファイルとしてエクスポートし、オブジェクトのスケールをマイクロメートルに調整します。3次元画像処理ソフトウェアでは、マウスのラクナ-小管腔の体積モデルを基本モデルとして選択し、異なる骨細胞モデルを構築します。
しきい値を低くすると、画像の光強度が減少し、小管の少ないラクナが得られます。次に、異なるラクナ-小管腔の厚さまたは樹状突起小管径の骨細胞モデルを開発します。より大きな骨細胞モデルまたはより小さな骨細胞モデルを、それぞれラッピングまたはスムージング操作を使用して構築します。
シミュレーションソフトウェアで流体の流れを作成するには、開発した共焦点画像ベースの形状をCFXソフトウェアにインポートします。単位寸法をナノメートルに設定します。次に、減算をクリックして、ラクナカニキュラースペースの単一のボディを実現します。
生成されたファセットを右クリックし、面をマージせずにファセットからソリッドドメインに変換します。meshをクリックし、要素サイズが0.06マイクロメートルの線形四面体要素を選択します。メッシュ収束スタディでメッシュを細分化します。
次に、サーフェスを選択し、仮想キューブの上側にある小管を流体入口として選択します。ボックスを使用して、他の5つの面の小管を流体出口として選択します。次に、メッシュをエクスポートします。
別の流体フローを作成した後、流暢なメッシュを CFX のセットアップ セクションにインポートします。[境界の挿入]オプションを使用して、面の入口と出口の 2 つの境界条件を定義します。流動入口圧力をそれぞれ300と0パスカルの入口と出口にかけます。
残りの表面を滑り止め状態の壁として扱います。材料ライブラリから、間質層流流体を水として扱います。熱伝達、燃焼、および熱輻射のセクションを none に設定します。
LCN の流体特性として乱流を選択します。次に、倍精度とダイレクト スタートを送信タイプとして使用してソフトウェアを実行します。CFDソフトウェアの結果セクションに新しいコンターを挿入します。
ドメインでの変数として骨細胞樹状膜上の壁せん断を選択することにより、流体流れせん断応力またはFFSSコンターを作成します。次に、流入口から始まるラクナ-小管ドメイン内に速度流線コンターを挿入します。若年骨細胞モデルにおける骨細胞および樹状膜上の平均FFSSは0.42パスカルであり、これは老化骨細胞モデルの0.13パスカルよりも有意に高かった。
FFSSは、モデル7とモデル8で最も高いFFSSを示したモデル8で見られるように、ラクナ小管腔が大きい骨細胞で増加しました。0.19 Pascalと0.13 Pascalの最低FFSS値は、それぞれモデル2とモデル4で観察され、小管密度が最も低かった。モデル5とモデル6で見られるように、樹状突起の直径が増加してもFFSSに大きな変化は観察されませんでした。
