この方法は、ヒト網膜全体にわたるRP細胞の表現型の違いを理解するのに役立ちます。Davide Ortolanが開発した解剖技術は、RPと網膜の間の剥離を生成する際に非常に再現性があります。また、REShAPEソフトウェアは、RPフラットマウントの大きな画像の分析に非常に優れています。
Davideが開発した方法は、異なるタイプの網膜変性疾患を有する患者からのRP表現型の地域差を研究するために使用することができる。はじめに、50ミリリットルの円錐形のチューブを5ミリリットルのマークよりわずかに下にカットします。ホットグルーを使用して、チューブチップを計量ボートの底に取り付けます。
次に、シリコーンエラストマーキットの2つのコンポーネントを10対1の比率で混合し、空気を閉じ込めないようにします。丸底チューブのこの球形の部分を含む計量ボートにミックスを注ぎます。室温で一晩シリコーンを硬化させます。
硬化したシリコン型から計量ボートと丸底チューブを取り外します。まず、1ミリリットルのシリンジに1700ミリモルのD-マンニトール溶液を入れ、21ゲージの針に取り付けます。眼の前房に穴を開けないように扁平に針を挿入し、400マイクロリットルの溶液を硝子体に注入します。
室温で45分間目を残します。細かいはさみと鉗子を使用して、前房をパースプラナの高さで切り開きます。後眼腔をカルシウムとマグネシウムを含むDPBSで満たします。
実体顕微鏡下で、網膜上の黄色の斑点として視覚化された黄斑を局在化させる。黄斑部を確実に保存しながら、眼を鼻、側頭、上、下などの象限に切ります。針が邪魔になる場合は取り外します。
蝶を目の後房に移し、カルシウムとマグネシウムを含むDPBSを含む100ミリメートルのペトリ皿に入れます。網膜を取り外す前に、毛様体縁にV字型の切り込みを入れて黄斑を含む花びらに印を付けます。網膜に横たわるすべての硝子体を持ち上げて切ります。
RPEを傷つけないように、すべての花びらの毛様体縁から網膜を切り取ります。組織を4%PFAに入れ、1時間インキュベートします。カルシウムとマグネシウムを含むDPBSで3回洗浄します。
組織を同じバッファーで満たされた容器に移し、摂氏4度で保管します。次に、カルシウムとマグネシウムを含むDPBSを含む100ミリメートルのペトリ皿にサンプルを移します。1.5ミリメートルの生検パンチで視神経乳頭を打ち抜きます。
網膜を収集し、摂氏4度の同じバッファーに保存します。RPE脈絡膜から強膜を除去するには、RPE脈絡膜層を周辺からそっと持ち上げます。次に、バンナスプリングハサミを使用して、強膜とRPEの間にある脈絡膜血管と結合組織を切り取ります。
強膜から完全に分離した後、RPE脈絡膜層を採取する。カルシウムとマグネシウムを含むDPBSで満たされた容器に組織を移し、摂氏4度で保管します。RPEコロイドを6ウェルプレートの1ウェルに移します。
サンプルをブロックし、室温で1時間透過処理します。透過処理バッファー中で1〜250の希釈で647フルオロフォアと結合したファロイジンを使用して、室温で1時間サンプルをインキュベートします。カルシウムとマグネシウムを含むDPBSで3回洗浄します。
RPE脈絡膜サンプルを50 x 75ミリメートルのスライドガラスに移し、平らにします。各花びらを2つにカットして、サンプルをより平らにします。疎水性ペンでフラットマウントの輪郭を描きます。
リポフスチン自家蛍光を消光するには、500マイクロリットルの自家蛍光消光器溶液を加え、室温で2分間インキュベートします。カルシウムとマグネシウムを含むDPBSでよく洗ってください。DPBSを取り外し、封入剤を追加します。
フラットマウントにカバーガラスを置き、マニキュアで密封します。ソフトウェアを開きます。[ディレクトリ] タブで、入力フォルダーと出力フォルダーを選択します。
出力ディレクトリで、ソフトウェアが入力ディレクトリまたはプロセスへのパスを自動的に変更するようにします。または、出力ディレクトリを手動で変更します。ヒートマップを生成するには、[カラー画像の作成]タブのドロップダウンメニューから[すべて]を選択します。
手動制限機能の使用の[いいえ]チェックボックスをオンにして、ソフトウェアが各画像で検出された最小値と最大値を使用できるようにします。[はい] チェックボックスをオンにして、各形状メトリック ヒート マップの値の範囲を手動で調整します。次に、制限の設定ボタンをクリックし、テキストボックスに値を挿入して、個々のパラメーターの範囲を選択します。
目的の値を変更したら、[保存]をクリックします。低いデフォルトをクリックして、すべての制限をリセットします。小さいセル サイズでセル サイズのしきい値を選択するには、分析に含める最小セルのサイズを挿入します。
上のセル サイズに、含める最大のセルのサイズを挿入します。[ピクセルを実単位に変換] で、ピクセル単位で分析を実行するには [いいえ] をオンにし、マイクロメートル単位で分析を実行するには [はい] をオンにします。[縮尺記号のピクセルの長さ] で、テキスト ボックスにピクセル値を入力します。
スケール バーのミクロンの長さで、対応する距離をマイクロメートル単位で入力します。分析を開始するには、[実行] を押します。このプロトコルにより、セルの位置がREShAPEによって生成されたRPEセル境界のセグメンテーションによって識別されるフラットマウントの単一プレーンイメージが得られます。
また、個々のRPEセルのセル面積を含む30の形状メトリックが、正しく識別されたすべてのRPEセルについて測定されます。網膜やその他の明るい物体の残留物に起因する黒いタイルは、RTフィルタードロップダウンメニューで使用可能なフィルタリングオプションの1つを選択することで削除できます。形状変更解析にRBG画像を使用すると、完全に黒いバイナリ画像が生成されます。
この場合、RGB画像をグレースケールに変換すると、正しくセグメント化されたバイナリ画像が生成されます。染色が最適でない場合、またはサンプルが傷によって損傷している場合は、細胞の大きな塊が単一の非常に大きな細胞として識別される可能性があります。この場合、セル サイズのしきい値を変更することで、ラージ オブジェクトを分析から除外できます。
平らな組織を得るためには、これらのステップに長い時間がかかる場合でも、RPと脈絡膜を強膜から分離する必要があります。RPフラットマウントの生成後、RP単層のさまざまな領域を調査できるように、追加のRPEマーカーを染色することができます。この方法を使用して、異なる網膜変性疾患に異なる感受性を持つ5つの異なるRP集団を発見しました。
