このプロトコルは、研究および再生アプリケーションのために、ヒトIPCを複雑な3次元神経網膜オルガノイドに分化させる簡単で効率的な方法を説明しています。この技術には、接着培養と浮遊培養の両方が含まれ、網膜オルガノイドとRP細胞の両方を選択的にピッキングして濃縮することができます。網膜変性疾患の細胞ベースの治療法を開発するための細胞源の実行可能で定期的な供給を提供することができます。
このような幹細胞由来網膜オルガノイドやRPE細胞は、眼の発達や遺伝性網膜疾患を研究するためのin vitroモデルとして有用である。この方法は、ヒトIPSC培養の取り扱いにすでに精通している研究室でも簡単に再現できます。視覚的デモンストレーションは、眼野の識別と、空間的位置と形態学的特徴に基づく神経網膜カップの分離を大幅にサポートします。
まず、使用済み培地を70〜80%コンフルエントなヒトIPSC培養液を6ウェルプレートで吸引します。PBSをウェルに加え、それらを回転させ、洗浄バッファーを吸引します。次に、1ミリリットルの細胞解離溶液またはCDSを各ウェルに加え、細胞が切り上げられるまでプレートを摂氏37度で5〜7分間インキュベートします。
CDSを吸引し、細胞懸濁液を15ミリリットルの遠沈管に回収します。チューブを室温で4分間1, 000 RPMで回転させます。上清を廃棄し、細胞ペレットを1.2ミリリットルのエッセンシャル8培地に再懸濁します。
1.5ミリリットルのIPSC培地と10マイクロモルのY27632を含むマトリックスコーティングされた6ウェルプレートの各ウェルに200マイクロリットルの細胞懸濁液を分注します。12〜24時間後、使用済みの培地を取り除き、培養を維持するためにY27632を含まない予熱した完全上昇培地を追加します。培養液が70〜80%のコンフルエントに達するまで、24時間ごとに培地を交換します。
0日目に、ヒトIPSC維持培地を吸引し、1ミリリットルのBFGFあたり1ナノグラムと1ミリリットルのNogginあたり1ナノグラムを含む分化誘導培地を6ウェルプレートに追加します。5%二酸化炭素インキュベーター内で摂氏37度で細胞をインキュベートします。初日目に、使用済み培地を吸引し、1ミリリットルのBFGFあたり1ナノグラムと1ミリリットルのノギンあたり10ナノグラムを含む分化誘導培地を追加します。
5%二酸化炭素インキュベーター内で摂氏37度で細胞を再びインキュベートします。2日目と3日目に、使用済みの培地を取り除き、1ミリリットルあたり10ナノグラムのNogginを含む分化誘導培地を追加します。6ウェルプレートに1ウェルあたり2ミリリットルの培地を加えた後、5%二酸化炭素インキュベーター内で細胞を摂氏37度でインキュベートし、24時間ごとに培地を交換します。
4日目に、使用済みの培地を取り除き、網膜分化培地またはRDMを追加します。同じ手順に従って、ウェルあたり2ミリリットルの培地を6ウェルプレートに追加し、培養液をインキュベートします。培地は毎日交換してください。
14日目と18日目頃に、初期の眼野前駆細胞からなる神経ロゼット様ドメインの出現について、10倍の倍率で顕微鏡下で培養を観察します。21日目と28日目頃に、4倍と10倍の倍率で顕微鏡下で培養物を観察し、神経上皮と眼表面上皮の連続した成長に囲まれた円形の3D神経網膜構造の中央島を持つ自己組織化された異なるEFPの出現を観察します。滅菌パスツールピペットを取り、片手でベースを持ち、もう片方の手でキャピラリーチップを持ちます。
ガラスが柔軟になるまで、キャピラリーチップの中央近くの領域を回転運動で火炎滅菌および加熱します。次に、炎から離れ、キャピラリーチップをすばやく外側に引っ張って、閉じたルーメンを持つ細かいキャピラリーチップを作成します。細い先端を炎の前で水平に持ち、外側にすばやく炎に通して、滑らかなフックまたはL字型の毛細管先端を作成します。
実体顕微鏡下で、キャピラリーフックの滑らかな外側曲率ゾーンを細かいスクープとして使用して、個々のEFPから整形式の神経網膜カップを手動で選択します。25日目と30日目に、4ミリリットルの事前に温めた網膜分化培地を低付着性60ミリメートルディッシュに入れて培養し、3D網膜オルガノイドを生成するための網膜カップを維持します。これは、神経網膜カップを収穫する前に行う必要があります。
1ミリメートルのマイクロピペットを100マイクロリットルの吸引にセットし、広い口径開口部を持つ1ミリリットルのマイクロチップを使用して吸引し、浮遊する網膜カップを吸引し、以前に準備した新鮮な低付着性培養皿に移します。網膜カップを非付着性浮遊培養としてRDMに維持し、5%二酸化炭素インキュベーター内で摂氏37度でインキュベートします。30日目と45日目に、部分供給法に従って、使用済み培地の半分の容量を取り除き、等量の新鮮な培地と交換します。
45日目と60日目に、100マイクロモルのタウリンを含むRDMで網膜オルガノイドをさらに2週間培養し、神経網膜前駆細胞のより良い生存と系統分化、および成熟網膜細胞タイプの発達をサポートします。網膜オルガノイドは、RT-PCRおよび免疫組織化学を用いて、いくつかの網膜前駆細胞マーカーの発現について、成熟のさまざまな段階で特徴付けられます。RT-PCRの結果、1ヶ月齢の網膜オルガノイドと2ヶ月齢の網膜オルガノイドにおける神経網膜マーカーの誘導と発現が確認されました。
神経網膜前駆マーカーChx10、PAX6、Otx2に対する抗体を用いた未熟網膜オルガノイドの免疫標識切片と、視細胞前駆体マーカーリカバーインおよびCRXに対する抗体を用いた成熟網膜オルガノイドの共焦点画像を示します。分化した光受容体細胞を有する網膜オルガノイドの顕著な最外層がズームされ、これらの画像に示される。初歩的な内部セグメントのような延長は白い矢印でマークされています。
EFPクラスターは、神経網膜カップを中心に、RPEの成長物の移動は、前縁に沿って色素沈着を示します。神経網膜島周辺の複数のEFPからの高分化色素性上皮成長がここに示されています。EFPのより高い倍率は、RPE前駆細胞の遊走帯および神経網膜カップを囲む眼表面上皮を示す。
色素細胞と非色素細胞の両方を含む未熟RPE細胞の単層を発達させた拡張接着培養をここに示します。完全に成熟した色素性RPE細胞の単層培養は、60日目に石畳の形態を示します。PAX6、MITF、およびRPE65を発現するRPE細胞をこの図に示します。
これらの画像は、歪んだ積層と縞模様の欠如を伴う網膜前駆細胞の異常な凝集体を有するEFPを表しています。ミニチュア神経網膜カップを有するが、RPEおよび眼表面上皮の周囲領域を欠いているEFPがこの図に示されている。代表的な画像は、浮遊培養で形成された不規則な神経網膜凝集体を示しています。
3〜4週間以内に眼野の効率的な誘導を達成するためには、IPCのほぼコンフルエントな成長培養物を使用して分化プロセスを開始することが非常に重要です。正常および患者特異的IPCから生成された網膜オルガノイドおよびRPE細胞は、網膜疾患モデルとして、また新規治療薬の試験に使用できます。
