プロトコルの重要性は、その完成に必要な短い時間での利便性にあります。これにより、茎状および固着性の毛状突起の高スループット、高濃度、および高度の分離が可能になります。この手法の主な利点は、その単純さです。
この技術では、植物源の毛状突起密度を考慮し、プロトコルを初めて実行しながら、顕微鏡を介して各ステップでの分離度を検査する必要があります。このテクニックを実演するのは、ボルカニセンターの大麻の専門家であるヌリットシャレフです。ハンマーと5リットルのプラスチック容器に入った硬くて平らな物体を使用して、ドライアイスブロックを小さくて細かいフレークに粉砕することから始めます。
大きなストレーナーを使用し、粉砕されていないドライアイスから細かいドライアイスフレークを別の5リットルのプラスチック容器にふるいにかけます。約200立方センチメートルのドライアイスフレークを直立した1リットルのガラスビーカーに注ぎます。砕いたドライアイスの最初の層に最大10グラムの冷凍大麻サティバ花序を加え、200立方センチメートルの細かく砕いたドライアイスの追加層で覆います。
次に、1リットルのガラスビーカーの開口部を1ミリメートルの網戸蚊帳の2〜3層で覆い、輪ゴムで固定します。次に、大きな丸底のステンレス鋼容器に液体窒素を注ぎます。小麦粉ふるいまたはふるいストレーナーに350マイクロメートルのメッシュを挿入して、小麦粉ふるいメッシュを下から覆います。
この小麦粉ふるいを、液体窒素で満たされた大きな丸底のステンレス鋼容器の上に置きます。ふるいにかけた塊の損失を最小限に抑えるために、容器の幅が小麦粉ふるいの幅を超えていることを確認してください。開口部が小麦粉ふるいに向かって下を向くように1リットルのガラスを振ることによって、トリコームを植物材料から分離します。
2〜3分ごとにビーカーを脇に置き、小麦粉のふるいに蓄積した砕いたドライアイスと植物材料をふるいにかけることができます。小麦粉のふるいを水平にふるいにかけ、下に置かれた丸底のステンレス鋼容器内の液体窒素への植物材料の通過を容易にします。次に、ステンレス容器に液体窒素を加え、レベルが低くなったら砕いたドライアイスを1リットルのガラスビーカーに加えます。
小麦粉ふるいの植物材料が枯渇したら、ガラスビーカーの使用済み植物材料に追加の10グラムの新鮮な植物材料を補充し、容器に十分な量の濃縮トリコームが集まるまでふるい分けプロセスを繰り返します。顕微鏡観察前に液体窒素に沈めたステンレス容器の底部に白色粉末状の物質が存在することを確認し、十分な毛状突起の採取を確認した。清潔で小さな丸底のステンレス鋼容器に少量の液体窒素を追加します。
次いで、150マイクロメートルのメッシュサイズの40×40センチメートルのマイクロシーブを2回折り曲げて20×20センチメートルの折り目を得、円錐状に開く。メッシュコーンを丸底のステンレス製容器の端に1つまたは2つの洗濯はさみで固定し、コーンの開いた部分が直立し、先のとがった部分が部分的に液体窒素に沈むようにします。完了したら、先に得られた白色粉末状物質を含む液体窒素をマイクロシーブコーンにそっと注ぎます。
幅の広いブラシを使用して、残りの植物材料を集めて、最初の容器から150マイクロメートルのメッシュコーンに移します。次に、洗濯はさみを容器の蓋から慎重に取り外し、マイクロシーブコーンを開いて、開いたマイクロシーブの中央に毛状突起を見つけます。マイクロシーブの四隅をすべて一緒に保持し、毛状突起を含む中央部分を液体窒素に浸します。
マイクロシーブを液体窒素に1分間ゆっくりと浸して振とうします。滅菌針を使用して、圧力の上昇を避けるために50ミリリットルの試験管のキャップに小さな穴を開けます。ふるいにかけていない植物の破片、ドライアイス、およびマイクロシーブの中央に包まれた大きな毛状突起を50ミリリットルの試験管にすくい取り、将来の使用のために摂氏マイナス80度で保管します。
液体窒素に沈めたふるいにかけた毛状突起をマイクロシーブに順次移し、注ぎ込みサイズを105から80、65、そして50マイクロメートルに減らします。各移し替えの後、マイクロシーブに残っている異なるサイズの毛状突起を別々に集め、ラベルを付けます。滅菌針を使用してチューブのキャップに小さな穴を開けます。
液体窒素に沈め、50マイクロメートルのマイクロシーブに包んだ目的の毛状突起を、予め冷やしたスプーンを使用してきれいなプレートに移します。次に、粉末状の毛状突起を、事前に冷却されたヘラを使用してラベル付きのプレチルド1.5ミリリットルのチューブにすばやく移し、さらに研究するためにチューブを摂氏マイナス80度ですぐに保管します。単離プロセスの初期段階では、完全に汚染されていない孤立した毛状突起で構成されていた最終的な分離生成物とは対照的に、葉の組織片が孤立した部分で優勢でした。
単離された顆粒頭状頭状茎および固着性毛状突起の品質は、最終単離ステップで観察された。この方法を用いて単離されたトリコームの純度は、従来のプロトコルと同等であった。繊細な茎の毛状突起の頭の構造は保持され、孤立した茎の毛状突起の頭全体が見え、完全な毛状突起の頭の構造が欠け、椎間板細胞のみが存在する従来の方法とは対照的でした。
単離されたトリコームのRNA抽出およびRNA完全性の推定は、9.4〜10の高いRNA完全性数またはRIN値を示し、ゲルクロマトグラフィーは高いRNA完全性を示した。150〜50マイクロシーブ単離のT袋様注入運動を注意深く行う。この方法は、大麻からのトリコームおよび他の植物種のトリコームのトランスクリプトームおよびおそらくプロテオミクス構成への洞察を提供することができます。
この手順に続いて、代謝およびトランスクリプトームの特性評価を実行できます。これらの追加の方法は、単離されたトリコームにおける遺伝子の発現レベルおよびそれらの代謝プロファイルを理解するのに役立つ。この技術により、さまざまな大麻品種の腺毛状突起のトランスクリプトーム特性評価が可能になりました。
