この作品は、ノリッジ研究公園就労 (JR) によってサポートされていた、共同工学と物理科学研究協議会/バイオ生物科学研究評議会 BBSRC 資金要約合成生物学研究センター (BB を付与します。/L014130/1) (M.J.S.、A.O.)。ジョン Innes の中心部知識の交換と商品化許可 (BB/KEC1740/1) (B.B.)。BBSRC 研究所戦略的プログラム グラント「自然から分子」(BB/P012523/1) とジョン ・ イネス財団 (A.O.)。PEAQ ベクトルを提供するためのジョージ ・ Lomonossoff とアンドリュー ・ デイビス写真撮影のために感謝したいと思います。

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著者が明らかに何もありません。

高を入れて真空浸潤では、様々 な下位アプリケーションにとってのトリテルペン化合物の分取用研究室で日常的に使用するこのプロトコルをことができます。ここで説明した真空浸潤装置は簡単に複製されます。真空リザーバーの追加ですが、浸潤室としてそのまま真空オーブンを単に再利用することは、必要な真空をプルする必要時間を短縮することをお勧め。適当なコンデンサーの追加を通して真空ポンプを保護することは理論的には理にかなっているが、私たちの研究室で私たちは必要がないとこれが見つけた。
場合は、葉が完全に浸潤の懸濁液に浸漬されていません、浸潤範囲が損なわれます。プラント ホルダーの上面を懸濁液のレベルに達するし、植物ホルダーが浸透浴のタイトなフィットを確保することによってこの問題を最小化します。図 2から植物ホルダー上面が際浸透浴で凹んでいる注意してください。これは浸潤お風呂の上部にアンカー ポイントを形作る者の中央の端にパネルで実現されます。浸潤懸濁液懸濁液レベルを維持するために定期的な追加が必要になります。これは最も大きなバッチ浸潤のコースで OD600の漸次の縮小を防ぐために余分な浸透を懸濁液の添加により達成されます。しかし、私たちの手で水の代替思えない分取スケールの期待利回りに顕著な効果を持っているこれは曲率の調査をしていませんが。浸潤の懸濁液の 1 つのバッチから潜入することができますどのように多くの植物はまだ未解決の問題であります。我々 は日常的に浸潤懸濁液の 1 つのバッチで 100 と 200 の植物の間に潜入します。さらに、いくつかの土壌浸透過程にわたって浸透サスペンションに濾すこと正常です。これは見つかっていない浸透効果に顕著な効果を持っています。
お勧め (しかし重要ではない) だが収穫時期に潜入していた葉だけを収穫する (いくつかの葉が成長している後浸透)。選択的な収穫は、関心の化合物に対する内因性不純物の割合が増加すると非生産的な組織で希釈を防止します。これは下流側の浄化のしやすさは、公称の影響とこれらのプロセスの規模が大きくなります。前駆体の供給を高めるに tHMGR を使用している場合、後浸透成長期間を開発するされた壊死の表現型がよく見られます。これは正常であり、実際にエイズ選択的収穫と乾燥工程。乾燥葉粉末は、涼しく乾燥した、暗い場所に、理想的には真空下で乾燥器で密封された容器で通常格納できます。これは興味の化合物の安定性に依存します。-80 ° C のフリーザーで保存するを選択する場合は注意が必要です。乾燥したことを確認ようにするこのコンテナーを開く前に常温の葉が防水コンテナーで、記憶域から削除します。そう失敗は、ダウン ストリームの処理を妨げ、葉のリウェッティングになります。
このプロトコルでは収穫後の手順は、説明のために提供され、実用的な化学が限られていることがありますこれらの者が経験を支援します。他の多くの天然物の抽出・精製技術に置き換えることができます。導入の詳細として PSE には多くの利点、禁則であるかもしれないしかし首都は市販の PSE 器具の費用、それは必須ではありません。塩基性イオン交換樹脂加工は伝統的な鹸化液液分配続いてを交換する非常に便利な方法です。しかし、カルボン酸基やエステルなどの基本的な条件の下で加水分解、官能基を含む製品に適したはありません。これらの製品は、塩基性イオン交換樹脂上に保持されるように期待されます。ただし、キャプチャのためにこれを悪用 (ここでは説明しません) の手順を解放する可能性があります。伝統的な鹸化が適切な場合、塩基性イオン交換樹脂加工は、便利な代替手段として提供しています。手順 9、クロマト グラフ法は、図 3に記載の化合物のため一般化する発見されています。しかし、増加の極性の化合物は、拡張 100% 酢酸エチルの溶出期間を必要があります。9.2 の手順を参照して下流側の細かい浄化完全化合物の特定し、規模にもよります。小規模な最適化されたグラデーション フラッシュ クロマトグラフィーの繰り返しラウンドで通常 NMR 解析の適切な純度を達成するために十分です。大きなスケールの結晶化はしばしば便利な代替手段です。困難な場合は、単離した化合物の所望の量によって分取やセミ分取高速液体クロマトグラフィー (HPLC) を用いることができます。代表的な化合物の範囲の下流側の浄化プロセスの例としては、他の場所で8で見つけることができます。
現在のプロトコルでは、ここに示された我々 の研究室で日常的に使用し、ユーティリティを証明しました。ただし、式プラットフォームのさらなる最適化のためのまだ重要な範囲があります。継続的な作業は、どのようにさらに経路工学を調査する研究室および差動制御タンパク質発現レベルの宿主細胞への毒性を仲介しながらさらに、トリテルペンの生産を改善できます。細胞内輸送システム20,21の操作と異なる細胞コンパートメント22,23, 酵素を改善できる道の方向を検討する可能性もあります。複数の酸化イベントの効率。主要器官の基になる形態を変更する潜在的な利点を検討も可能性があります。たとえば、過剰発現シロイヌナズナにおける HMGR のドメインの膜は植物24; 小胞体の肥大を誘導するために観察されています。CYP450 活動の重要なサイト。このプロトコルはトリテルペン類、グラム スケール量ミリグラムの生産に最適で、下流の研究 (例えば、構造活性の組織的な探検の化合物へ研究の場で用いることができます。リレーションシップ、および事前調査の薬力学及び薬物動態学的特性に導く臨床的に興味深い化合物)。しかし、プラットフォームは直線的、使用される、植物の数と agroinfiltration を介して一過性発現の実用性を増やすことによって単に信頼性の高いスケーラブルな製薬蛋白質の生産のための産業規模で実証されています。14、従ってある高価値トリテルペンの商業生産の拡張にこのプラットフォームの潜在的です。また、それはまた安定した形質転換体確定欲求発現の生合成経路を運ぶ、大量培養の生産を想像することと '農業' トランスジェニック(名) 栽培の継続的な系統商業的価値の異なる化合物を生産しています。

トリテルペン、最大の 1 つ、植物天然物のほとんどの構造的に多様な家族。彼らの広大な多様性にもかかわらずすべてトリテルペン天然物は同じ線形前駆体 2, 3-オキシドスクアレン、植物におけるメバロン酸経路の製品に由来すると考えられています。2, 3 オキシドスクアレンの環化反応を開始し、オキシドスクアレン閉環酵素 (受動) と呼ばれる酵素の家族によって制御されます。この環化反応ステップは、何百もの異なるトリテルペン足場性質1から報告されている、多様化の最初のレベルを表します。これらの足場はチトクローム p450 に限定されない、(CYP450s)1,2を含む酵素を調整することによってさらに多様化します。このような生合成経路は、巨大な複雑さ、時々 親トリテルペンからほとんど認識である最終製品の結果につながります。たとえば、tirucallane タイプ3の四環系トリテルペンから派生する強力な殺虫剤は、摂食のリモノイド アザジラクチンの複雑な構造が考えられています。
多くトリテルペンから派生した自然な製品であっても比較的そのまま親足場では、医薬関連生物活性4,5,6,7を所有する示されています。しかし、これまでこの可能性に翻訳はないクリニックでトリテルペンから派生した薬の茄多。これは間違いなく (少なくとも部分的に) 化合物のこのクラスに実用的な合成アクセスが制限の結果、問題の構造活性相関の探鉱・開発を抑えることができる伝統的な医薬品候補をリード化学のワークフロー。
(名) ベンサミアーナ葉に他の植物種のトリテルペンの生合成酵素の一過性の発現は、新しい高付加価値トリテルペン製品 (図 1) の製作に向けてオキシドスクアレン閉の 2, 3 の内因性供給をそらすことができます。このプロセスは、候補酵素の機能的特徴し、重要な自然発生する代謝産物の生合成経路を再構築する使用することができます。同様に、この新規トリテルペン製品、構造活性相関の体系的な検証ができるように構造的に関連の類似のライブラリにつながる戦略を生成する生合成アプローチの組合せでも悪用することができます。生物学的活性の鉛の化合物の8,9。
Agroinfiltration は(名) ベンサミアーナ葉に一過性発現を達成するための効率的な手段です。プロセスには、関心の二項式 construct(s) を運ぶA. 根頭がんしゅ病菌の懸濁液で葉の浸潤が含まれます。これは、気孔、細胞間隙に空気を追い出し、 A. 根頭がんしゅ病菌のサスペンションの交換を介して液体を強制する圧力のアプリケーションを介して達成されます。細菌は、浸透した葉のティッシュのローカライズと一時的な蛋白質の表現の結果として、植物細胞の内部にそれぞれ T Dna を転送します。
適切な任意のバイナリ ベクトル中利用可能な一過性発現に使用されるかもしれない遺伝子組換え植物を生成するササゲ モザイク ウイルス CPMV から派生したHypertranslational (HT) タンパク質発現システム10, 11. このシステムでは目的の遺伝子が隣接している非翻訳領域 (UTR) CPMV RNA 2 から。5' UTR ウイルス複製12への依存なしで非常に高いレベルのタンパク質翻訳結果の変更が含まれています。この手法は、プロトコルと互換性のある構成要素 (pEAQ -HT- DEST)10,11をクローニング部位特異的組換えを含む (pEAQ) 簡単および簡単な二進ベクトル シリーズに開発されています。ほとんど pEAQ ベクトルもトマトふさふさしたスタント ウイルス由来 P19 サイレンシング抑制遺伝子13 coinfiltrate 別 P19 運ぶひずみする必要性を回避して非常に支払う式カセットの T-DNA 部分内に含むホストの高度な蛋白質の表現は植物細胞10,11です。
(名) 植物の使用発現用宿主植物の生合成経路を操作するとき特定の利点があります。セル アーキテクチャは、本質的に適切な mRNA やタンパク質の処理と必要な共同酵素、還元酵素 (CYP450s) の代謝前駆体を有するほか、適切な区分をサポートします。炭素源は光合成です。したがって、植物は、単に入力として水 CO2 (空気) から、日光を必要とする良質の堆肥で栽培できます。プラットフォームはまた、共発現蛋白質のさまざまな組み合わせのため非常に便利なA. 根頭がんしゅ病菌、大規模な発現式を構築する必要性を否定することの異なった緊張の共同含浸による facilely これ達成することができます。カセット。さらに、プロセス直線的かつ確実にスケールできます実験で使用される植物の数を増やすことによって単に。
私たちの研究室の前の仕事は、分取スケール実験は、このプラットフォームの有用性を実証しています。これは隔離された製品のグラム量を達成するためを新規トリテルペンの活性アッセイおよびスケールで使用するための準備を含まれています。さらに、異種トリテルペン製品の蓄積を増やすことができますいくつかはレート制限還元酵素 (tHMGR)、3-ヒドロキシ 3-methyglutary-コエンザイムの N ターミナル切り捨て、フィードバックを区別しないフォームの共発現によるフォールド上流メバロン酸経路8酵素。
このような分取スケール実験の鍵は、浸透過程のアップ スケールを便利にする機能です。典型的な実験で何百もの植物の数十は、分離製品の目標量を達成するために必要があります。運用要求、および多くの場合たいへん時間がかかりますが (言うまでもなく注射器を使用して) 個々 の葉を手で浸潤レンダリングこの手法を日常のスケール アップのため実用的ではないです。真空浸潤は演算子のスキルレベルには依存しないにより、葉の表面のより大きい区域の浸透と手浸潤上の利点を提供しています。この手順は、製薬タンパク質14の大規模な生産のため商業的に使用されます。このプロトコルは、市販部品から構築することができます簡単に複製可能な真空浸潤装置を利用しています。これにより、迅速かつ実用的なバッチ浸透植物の何百もの時間の短い期間で主事まで 4 つの植物の同時浸透 (図 2 a -2b)。浸潤の商工会議所 (図 2 f) を形作る真空オーブン真空浸潤装置で構成されます。オーブンは、真空リザーバーを介してポンプに接続されます。これは、浸潤室で必要な真空を達成するために必要な時間を大幅に削減します。植物は特注のホルダーで保護、 A. 根頭がんしゅ病菌の懸濁液でいっぱい 10 L のステンレス製水槽に反転 (図 2 a -2 c)。植物の地上部の完全な浸漬は、効率的な浸透のため重要です。浸潤チャンバ内で風呂の水を入れます (図 2 d -2e)、および空気を引き出す葉間質性スペースに適用される真空。880 mbar (約 1 分かかりますプロセス) によって圧力が減った後浸透室に戻されるすぐに大気圧の浸透が完了するとすぐにオーブン入口弁を開くことによって 20-30 秒。
5 日後植物材料は収穫とその後の抽出とご希望のプロダクトの分離の準備ができて。この点から、プロセスは単に天然物抽出・精製葉材の天然物化学者になじみのあるワークフローの 1 つです。初期抽出とそれに続く浄化のための多くの異った方法には、15が存在しています。正確な条件・方法の最も適切な選択はスキルや機器の可用性に加えて、興味の化合物の特定の化学的性質に大きく依存。完全に一般化、ステップバイ ステップ、関心のトリテルペン製品の盲目的に続くことができる分離製品に収穫された植物葉材料の下流の処理法はこのプロトコル、不可能はないだろうそれこれを行うにしようとする適切です。ただし、このプロトコルは、当研究室と私たちの経験で最も酸素アグリコン トリテルペン製品の汎化可能な証明しているプロセスの初期の段階のいくつかのメソッドで使用される基本的なワークフローの概要を提供します。これは、2 つの比較的稀な技術、すなわち、高圧溶媒抽出 (PSE)、強塩基性のイオン交換樹脂を用いたクロロフィル除去のための便利な異種相法を含まれます。
PSE は、固体マトリックスからの小さな有機分子の抽出の非常に効率的な手法です。圧力 (約100-200 bar) の下での抽出が実行されます、沸騰を超える緩和の温度を使用する能力をされている主な利点は、抽出溶媒のポイントします。時間と単純な還流またはソックスレー抽出16など他のホット溶剤技術と比較されたとき完全な抽出を達成するために必要な溶媒の量が大幅に削減することができます。商業ベンチ上 PSE 器具があります、交換可能な抽出セル、および自動溶剤処理、加熱、および監視を利用しました。これはこのテクニックを非常に便利になります。また、間違いなく少ない危険、特に限られた実用的な化学の経験を持つ演算子です。
還流液液分配が続く原油葉抽出物の鹸化はそれに続く浄化や分析の前にクロロフィルの一括除去のための一般的な手法です。しかし、この厳しいことがしばしばする運用より大きいスケールで。さらに、インターフェイス、またはエマルジョンの形成による製品の損失の検出が問題となります。異種相加水分解を実行する強塩基性イオン交換樹脂の使用は、便利な代替手段として使用できます。加水分解のクロロフィルの色素部分は樹脂に付着のまま、単に濾過により除去することができます。このプロトコルは、市販の塩基性イオン交換樹脂を採用しています以前に報告された分析手順17の分取スケール適応を利用しています。
以下この植物ベースのプラットフォームを活用したトリテルペンの分取スケールの生産のための詳細なプロトコルについて述べる。このプロトコルを使って定期的に当研究室で核磁気共鳴 (NMR) 分光法によるそのような構造解析用十分離トリテルペン製品のミリグラムの何百もの準備および/または機能でさらに研究を試金。

<table><tbody><tr><td>GC-MS instrument</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Thermocycler suitable for performing PCR reactions</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Gel electrophoresis apparatus</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Adjustable air displacement micropipettes (Sizes : 1000 &amp;micro;L, 200 &amp;micro;L, 100 &amp;micro;L, 20 &amp;micro;L, 10 &amp;micro;L, and 2 &amp;micro;L )</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Wide top liquid nitrogen carrier (size: 2 L)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Benchtop microcentrifuge (Capacity: 24 x 1.5/2mL, Max. speed: =/&gt; 15000 rpm)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Benchtop centrifuge (Capacity: 20 x 50 mL, Max. speed: =/&gt; 4000 rpm)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Large Floor-standing centrifuge (Capacity: 4 x 1L, Max. speed: =/&gt; 4000 rpm)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Standing incubator</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Shaking incubator (Flask Clamp sizes: 10 mL, 50 mL, 2 L)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge bottles (1 L)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Vacuum infiltration apparatus</td><td>bespoke</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>9 x 9 cm plant pots</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Freeze drying apparatus (=/&gt; 8 litre condenser capacity)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Buchi SpeedExtractor 914 with 120 mL extraction cells (PSE instrument)</td><td>Buchi</td><td>SpeedExtractor E-914</td><td></td></tr><tr><td>Rotary evaporator apparatus</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Evaporation flasks (Sizes: 100 mL, 500 mL, 1 L, 2 L)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Duran bottles (Sizes: 1 L, 10 L)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Conical flasks (Sizes 100 mL, 2 L)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Spatulas (assorted sizes)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Analytical balance (5 figures)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Balance (2 figures)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Measuring cylinders (10 mL, 100 mL, 1 L)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>A -80 freezer</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Biotage Isolera instrument with 250 mL collection rack and bottles (automated flash chromatography instrument</td><td>Biotage</td><td>ISO-1EW</td><td></td></tr><tr><td>Safety glasses</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Lab coat</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Autoclave</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Consumables&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micropipette tips (Sizes : 1000 &amp;micro;L, 200 &amp;micro;L, 100 &amp;micro;L, 20 &amp;micro;L, 10 &amp;micro;L, and 2 &amp;micro;L )</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge tubes (Size: 2 mL)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge tubes (Sizes: 15 mL, 50 mL)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Disposable Transfer pipettes (size 2 mL)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Petri dishes (Size: 100 mL)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Biotage&amp;reg; SNAP KP-SIL 100 g flash cartridges</td><td>Biotage</td><td>FSK0-1107-0100</td><td></td></tr><tr><td>HPLC vials (1 mL), vial inserts and caps</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Disposable purple nitrile gloves</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Top filter for E-914, cellulose</td><td>Buchi</td><td>51249</td><td></td></tr><tr><td>Bottom filter for E-916 / 914, glass fiber</td><td>Buchi</td><td>11055932</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Quartz sand, 0.3 - 0.9 mm</td><td>Buchi</td><td>37689</td><td></td></tr><tr><td>Celite 545 (diatomaceous earth)</td><td>Simga-Alrich</td><td>22140-1KG-F</td><td></td></tr><tr><td>Silica gel 60 (0.040 -0.0063 mm)</td><td>Merck</td><td>1.09385.5000</td><td></td></tr><tr><td>2-(N-morpholino)-ethanesulphonic acid</td><td>Melford</td><td>B2002</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Simga-Alrich</td><td>208337-100G</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Simga-Alrich</td><td>60377-1KG</td><td></td></tr><tr><td>3&amp;rsquo;5&amp;rsquo;-dimethoxy-4&amp;rsquo;-acetophenone (acetosyringone)</td><td>Simga-Alrich</td><td>D134406-1G</td><td></td></tr><tr><td>Rifampicin</td><td>Alfa Aesar</td><td>J60836</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin sulfate</td><td>Gibco</td><td>11815-032</td><td></td></tr><tr><td>Streptomycin</td><td>Simga-Alrich</td><td>S6501-100G</td><td></td></tr><tr><td>Gentamycin</td><td>MP biomedicals</td><td>190057</td><td></td></tr><tr><td>Agarose LE gel</td><td>Melford</td><td>MB1203</td><td></td></tr><tr><td>LB broth Millar</td><td>Simga-Alrich</td><td>L3522-250G</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Simga-Alrich</td><td>A5306-250G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Simga-Alrich</td><td>S5886-500G</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Simga-Alrich</td><td>P9541-500G</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;.7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Alrich</td><td>M2773-500G</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Alrich</td><td>G7021-100G</td><td></td></tr><tr><td>Ambersep&amp;reg;&amp;nbsp;900 hydroxide (basic ion exchange resin)</td><td>Sigma-Alrich</td><td>06476-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Hexane</td><td>Fisher</td><td>H/0406/PB17</td><td></td></tr><tr><td>Ethyl acetate</td><td>Fisher</td><td>E/0900/PB17</td><td></td></tr><tr><td>Dichloromethane</td><td>Fisher</td><td>D/1852/PB17</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher</td><td>M/4056/PB17</td><td></td></tr><tr><td>Ethidium bromide</td><td>Sigma-Alrich</td><td>E7637-1G</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>VWR</td><td>20821-330</td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q water</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Levington F1 Compost</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Levington F2 Compost</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit (Plasmid purification kit).</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>NEB 5-alpha Competent E. coli</td><td>Supplier New England Biolabs Ltd</td><td>C2987I</td><td></td></tr><tr><td>pEAQ-HT-DEST1 vector</td><td>Lomonossoff laboratory John Innes Center</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>pDONR207</td><td>Thermo-Fisher</td><td>pDONR207</td><td></td></tr><tr><td>A. tumefaciens LBA4404</td><td>Thermo-Fisher</td><td>18313015</td><td></td></tr><tr><td>GATEWAY LR CLONASE(tm) II ENZYME MIX (site-specific recombination cloning protocol)</td><td>Thermo-Fisher</td><td>11791020</td><td></td></tr><tr><td>GATEWAY BP CLONASE (tm) II ENZYME MIX (site-specific recombination cloning protocol)</td><td>Thermo-Fisher</td><td>11789020</td><td></td></tr><tr><td>GO TAQ G2 GREEN MASTER MIX</td><td>Promega UK Ltd</td><td>M7822</td><td></td></tr><tr><td>PHUSION HIGH FIDELITY DNA POLYMERASE</td><td>New England Biolabs Ltd</td><td>M0530S</td><td></td></tr><tr><td>dNTP SET 100mm</td><td>Thermo-Fisher</td><td>10297018</td><td></td></tr><tr><td>RNEASY PLANT MINI KIT</td><td>Qiagen Ltd</td><td>74904</td><td></td></tr><tr><td>RQ1 RNASE-FREE DNASE</td><td>Promega UK Ltd</td><td>M6101</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen SuperScript III First-Strand Synthesis System</td><td>Fisher</td><td>10308632</td><td></td></tr><tr><td>Trytone</td><td>Sigma-Alrich</td><td>T7293-250G</td><td></td></tr><tr><td>Nicotiana benthamiana seeds</td><td>any reputable supplier</td><td>n/a</td><td></td></tr></tbody></table>

transient expression in nicotiana benthamiana leaves for triterpene production at a preparative scale

トリテルペン、最大の 1 つ、植物天然物のほとんどの構造的に多様な家族。多くのトリテルペン誘導体医薬関連の生物学的活性を有することが示されています。しかし、これまでこの可能性に翻訳はないクリニックでトリテルペンから派生した薬の茄多。これは間違いなく (少なくとも部分的に) 化合物のこのクラスに実用的な合成アクセスが制限の結果、問題の構造活性相関の探鉱・開発を抑えることができる伝統的な医薬品候補をリード化学のワークフロー。彼らの広大な多様性にもかかわらずトリテルペン、すべてから派生した単一の線形の前駆体 2, 3 オキシドスクアレン閉。(名) 植物の生合成酵素の過渡の異種発現は、自然このホストによって生成されるしない新しいトリテルペン高付加価値製品の生産に向けてオキシドスクアレン閉の 2, 3 の内因性供給をそらすことができます。農業-浸潤はある(名) ベンサミアーナに一過性発現を達成するための効率的な手段です。プロセスには、関心の式 construct(s) を運ぶアグロバクテリウムの懸濁液と植物葉の浸潤が含まれます。追加A. 根頭がんしゅ病菌の共同浸潤ひずみ運ぶ前駆体供給を大幅向上する酵素は増加するエンコード式構造が得られます。5 日間の期間の後浸透した葉の材料を収穫し、抽出し、結果として得られるトリテルペン製品を分離処理できます。これは、実験で使用される植物の数を増やすことによって単に直線的かつ確実にスケーラブルなプロセスです。ここにはこの植物ベースのプラットフォームを活用したトリテルペンの迅速分取スケール用プロトコルを記述しました。プロトコルは、植物の何百もの時間の短い期間での浸潤バッチを有効にする 4 つまでの植物の同時浸透を可能にする、簡単に複製可能な真空浸潤装置を利用しています。

典型的な分離収穫調査、ターゲット化合物の化学的安定性および浄化プロセスに挑戦はいかがでしたの下で酵素/酵素の組み合わせに依存しています。我々 は以前 β-アミリンの分離の利回りを報告しているに至る 0.12 グラムあたり 3.87 mg コンビナトリアル生合成実験から誘導体乾燥(名) ベンサミアーナリーフ パウダー。これらの化合物は酸化のレベルで広くあったし、酵素 (図 3)8の不自然な組み合わせが含まれています。このプロトコルは日常的に使用当研究室で数十または精製した製品構造特性のミリグラムの数百を生成する NMR 分光学および下流の機能アッセイによって。98% 以上の純度でトリテルペン足場 β-アミリンの 0.8 g を生産することによってこのプラットフォームの分取の有用性も実証しました。この実験 459 植物を使用し、ドライのグラムあたり 3.3 mg の単離収率を表します(名) ベンサミアーナ葉粉末8。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58169/58169fig1.jpg"> 図 1: 概要。新トリテルペン高付加価値製品の分取の生産に向けてオキシドスクアレン閉の 2, 3 の内因性供給を転換する(名) ベンサミアーナ葉の生合成酵素の一過性の発現を悪用するプロセスの模式図。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58169/58169fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58169/58169fig2.jpg"> 図 2: 侵入者の建設やプロセスの真空、)オーダーメイドの一戸建て植物ホルダー 1 つの翼。b) Bespoke 植物ホルダー翼を接続します。c) 反転と植物の水没。d) 浸透浴の挿入。e) 浸潤浸潤チャンバー内でお風呂。f) 完全な真空の侵入者: (1) 真空ポンプ真空ポンプ真空リザーバー (3) 真空タンク分離バルブ (4) 真空リザーバーと浸潤商工会議所圧力計 (5) (6) の吸気バルブ (7) 間の接続から接続 (2)浸潤商工会議所 (8) 真空貯水池があります。g) 代表の葉緑色蛍光タンパク質 (GFP) を発現コンストラクトを浸透させた 1 つの工場から 5 日後の浸潤成長後。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58169/58169fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58169/58169fig3.jpg"> 図 3: 以前このプロトコル8を使用して β-アミリン誘導体の分取用の代表的な結果を報告します。このテーブルは分離の利回り順に。列は、相対値の色の表示を条件付きで書式設定されます。赤 = 高、緑 = 低 (しかし中間黄色)。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58169/58169fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

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Transient Expression in Nicotiana Benthamiana Leaves for Triterpene Production at a Preparative Scale

一過性発現タバコにおける葉トリテルペン用分取スケールで

ベンサミアーナ タバコ葉の生合成酵素の過渡の異種発現は新トリテルペン高付加価値製品の生産に向けてオキシドスクアレン閉の 2, 3 の内因性供給をそらすことができます。ここは、トリテルペン、この強力な植物ベースのプラットフォームを活用した類縁体の急速 (5 日間) 分取スケールの生産のための詳しいプロトコルを記述しました。

The triterpenes are one of the largest and most structurally diverse families of plant natural products. Many triterpene derivatives have been shown to ...

transient-expression-nicotiana-benthamiana-leaves-for-triterpene

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Transient Expression in Nicotiana Benthamiana Leaves for Triterpene Production at a Preparative Scale

17.2K ビュー.  John Innes Centre. ベンサミアーナ タバコ葉の生合成酵素の過渡の異種発現は新トリテルペン高付加価値製品の生産に向けてオキシドスクアレン閉の 2, 3 の内因性供給をそらすことができます。ここは、トリテルペン、この強力な植物ベースのプラットフォームを活用した類縁体の急速 (5 日間) 分取スケールの生産のための詳しいプロトコルを記述しました。

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Transient Gene Expression in Tobacco using Gibson Assembly and the Gene Gun

In order to target a single protein to multiple subcellular organelles, plants typically duplicate the relevant genes, and express each gene separately using complex regulatory strategies including differential promoters and/or signal sequences. Metabolic engineers and synthetic biologists interested in targeting enzymes to a particular organelle are faced with a challenge: For a protein that is to be localized to more than one organelle, the engineer must clone the same gene multiple times. This work presents a solution to this strategy: harnessing alternative splicing of mRNA. This technology takes advantage of established chloroplast and peroxisome targeting sequences and combines them into a single mRNA that is alternatively spliced. Some splice variants are sent to the chloroplast, some to the peroxisome, and some to the cytosol. Here the system is designed for multiple-organelle targeting with alternative splicing. In this work, GFP was expected to be expressed in the chloroplast, cytosol, and peroxisome by a series of rationally designed 5&#8217; mRNA tags. These tags have the potential to reduce the amount of cloning required when heterologous genes need to be expressed in multiple subcellular organelles. The constructs were designed in previous work11, and were cloned using Gibson assembly, a ligation independent cloning method that does not require restriction enzymes. The resultant plasmids were introduced into Nicotiana benthamiana epidermal leaf cells with a modified Gene Gun protocol. Finally, transformed leaves were observed with confocal microscopy.

This work describes a novel method for selectively targeting subcellular organelles in plants, assayed using the BioRad Gene Gun.

ギブソンアセンブリと遺伝子銃を用いてタバコの一過性の遺伝子発現

In order to target a single protein to multiple subcellular organelles, plants typically duplicate the relevant genes, and express each gene separately ...

環境学

Expression of Recombinant Cellulase Cel5A from Trichoderma reesei in Tobacco Plants

Cellulose degrading enzymes, cellulases, are targets of both research and industrial interests. The preponderance of these enzymes in difficult-to-culture organisms, such as hyphae-building fungi and anaerobic bacteria, has hastened the use of recombinant technologies in this field. Plant expression methods are a desirable system for large-scale production of enzymes and other industrially useful proteins. Herein, methods for the transient expression of a fungal endoglucanase, Trichoderma reesei Cel5A, in Nicotiana tabacum are demonstrated. Successful protein expression is shown, monitored by fluorescence using an mCherry-enzyme fusion protein. Additionally, a set of basic tests are used to examine the activity of transiently expressed T. reesei Cel5A, including SDS-PAGE, Western blotting, zymography, as well as&#160;fluorescence and dye-based substrate degradation assays. The system described here can be used to produce an active cellulase in a short time period, so as to assess the potential for further production in plants through constitutive or inducible expression systems.

Expression of Recombinant Cellulase Cel5A from Trichoderma reesei in Tobacco Plants

Tobacco plants were used to produce a fungal cellulase, TrCel5A, via a transient expression system. The expression could be monitored using a fluorescent fusion protein, and the protein activity was characterized post-expression.

組換えセルラーゼCEL5Aの式から<em&gt;トリコデルマ·</em&gt;タバコ植物における

Cellulose degrading enzymes, cellulases, are targets of both research and industrial interests. The preponderance of these enzymes in difficult-to-culture ...

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug used to treat depression and anxiety by binding to the serotonin transporter with high-affinity, blocking serotonin reuptake. Here we report an efficient procedure and a set of tools to stabilize, express, purify, and crystallize serotonin transporter-antibody complexes bound to S-citalopram and other antidepressants. Mutations which stabilize the serotonin transporter were identified using an S-citalopram binding assay. Serotonin transporter expressed in baculovirus-transduced HEK293S GnTI- cells, was reconstituted into proteoliposomes and used to raise high-affinity antibodies. We have developed a strategy to discover antibodies that are useful for structural studies. A straightforward approach for the expression of antibody fragments in Sf9 cells has also been established. Transporter-antibody complexes purified using this procedure are well-behaved and readily crystallize, producing complexes with S-citalopram that diffract X-rays to 3-4 &#197; resolution. The strategies developed here can be utilized to determine the structure of other challenging membrane proteins.

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

This manuscript describes how to screen for thermostabilizing mutations, purify the human serotonin transporter, generate high affinity antibodies, and crystallize the serotonin transporter-antibody complex bound to the antidepressant drug S-citalopram. This protocol can be adapted to the study of other challenging membrane transporters, receptors, and channels.

にバインドされた熱安定、発現、精製、およびヒトセロトニントランスポーターの結晶化<em&gt; S</em&gt; - シタロプラム

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug ...

生化学

A Customizable Approach for the Enzymatic Production and Purification of Diterpenoid Natural Products

Diterpenoids form a diverse class of small molecule natural products that are widely distributed across the kingdoms of life and have critical biological functions in developmental processes, interorganismal interactions, and environmental adaptation. Due to these various bioactivities, many diterpenoids are also of economic importance as pharmaceuticals, food additives, biofuels, and other bioproducts. Advanced genomics and biochemical approaches have enabled a rapid increase in the knowledge of diterpenoid-metabolic genes, enzymes, and pathways. However, the structural complexity of diterpenoids and the narrow taxonomic distribution of individual compounds in often only a single species remain constraining factors for their efficient production. Availability of a broader range of metabolic enzymes now provide resources for producing diterpenoids in sufficient titers and purity to facilitate a deeper investigation of this important metabolite group. Drawing on established tools for microbial and plant-based enzyme co-expression, we present an easily operated and customizable protocol for the enzymatic production of diterpenoids in either Escherichia coli or Nicotiana benthamiana, and the purification of desired products via silica chromatography and semi-preparative HPLC. Using the group of maize (Zea mays) dolabralexin diterpenoids as an example, we highlight how modular combinations of diterpene synthase (diTPS) and cytochrome P450 monooxygenase (P450) enzymes can be used to generate different diterpenoid scaffolds. Purified compounds can be used in various downstream applications, such as metabolite structural analyses, enzyme structure-function studies, and in vitro and in planta bioactivity experiments.

Here we present easy to use protocols for producing and purifying diterpenoid metabolites through the combinatorial expression of biosynthetic enzymes in Escherichia coli or Nicotiana benthamiana, followed by chromatographic product purification. The resulting metabolites are suitable for various studies including molecular structure characterization, enzyme functional studies, and bioactivity assays.

ジテルペノイド天然物の酵素生産と精製のためのカスタマイズ可能なアプローチ

Diterpenoids form a diverse class of small molecule natural products that are widely distributed across the kingdoms of life and have critical biological ...

Efficient Agroinfiltration of Plants for High-level Transient Expression of Recombinant Proteins

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing worldwide demand for pharmaceuticals due to its limited scalability and high cost. Plants have shown to be one of the most promising alternative pharmaceutical production platforms that are robust, scalable, low-cost and safe. The recent development of virus-based vectors has allowed rapid and high-level transient expression of recombinant proteins in plants. To further optimize the utility of the transient expression system, we demonstrate a simple, efficient and scalable methodology to introduce target-gene containing Agrobacterium into plant tissue in this study. Our results indicate that agroinfiltration with both syringe and vacuum methods have resulted in the efficient introduction of Agrobacterium into leaves and robust production of two fluorescent proteins; GFP and DsRed. Furthermore, we demonstrate the unique advantages offered by both methods. Syringe infiltration is simple and does not need expensive equipment. It also allows the flexibility to either infiltrate the entire leave with one target gene, or to introduce genes of multiple targets on one leaf. Thus, it can be used for laboratory scale expression of recombinant proteins as well as for comparing different proteins or vectors for yield or expression kinetics. The simplicity of syringe infiltration also suggests its utility in high school and college education for the subject of biotechnology. In contrast, vacuum infiltration is more robust and can be scaled-up for commercial manufacture of pharmaceutical proteins. It also offers the advantage of being able to agroinfiltrate plant species that are not amenable for syringe infiltration such as lettuce and Arabidopsis. Overall, the combination of syringe and vacuum agroinfiltration provides researchers and educators a simple, efficient, and robust methodology for transient protein expression. It will greatly facilitate the development of pharmaceutical proteins and promote science education.

Plants offer a novel system for the production of pharmaceutical proteins on a commercial scale that is more scalable, cost-efficient and safe than current expression paradigms. In this study, we report a simple and convenient, yet scalable approach to introduce target-gene containing Agrobacterium tumefaciens into plants for protein transient expression.

組換えタンパク質の高レベルの一過性発現のための植物の効率的なアグロ

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing ...

生物学

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short period of time. However, this technology is only just beginning to be applied to large-scale production as many technological obstacles to scale up are now being overcome. Here, we demonstrate a simple and reproducible method for industrial-scale transient protein production based on vacuum infiltration of Nicotiana plants with Agrobacteria carrying launch vectors. Optimization of Agrobacterium cultivation in AB medium allows direct dilution of the bacterial culture in Milli-Q water, simplifying the infiltration process. Among three tested species of Nicotiana, N. excelsiana (N. benthamiana &#215; N. excelsior) was selected as the most promising host due to the ease of infiltration, high level of reporter protein production, and about two-fold higher biomass production under controlled environmental conditions. Induction of Agrobacterium harboring pBID4-GFP (Tobacco mosaic virus-based) using chemicals such as acetosyringone and monosaccharide had no effect on the protein production level. Infiltrating plant under 50 to 100 mbar for 30 or 60 sec resulted in about 95% infiltration of plant leaf tissues. Infiltration with Agrobacterium laboratory strain GV3101 showed the highest protein production compared to Agrobacteria laboratory strains LBA4404 and C58C1 and wild-type Agrobacteria strains at6, at10, at77 and A4. Co-expression of a viral RNA silencing suppressor, p23 or p19, in N. benthamiana resulted in earlier accumulation and increased production (15-25%) of target protein (influenza virus hemagglutinin).

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Transient protein production in Nicotiana plants based on vacuum infiltration with Agrobacteria carrying launch vectors (Tobacco mosaic virus-based) is a rapid and economic approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins. We simplified the procedure and improved target accumulation by optimizing conditions of bacteria cultivation, selecting host species, and co-introducing RNA silencing suppressors.

最適化と利用の<em&gt;アグロバクテリウム</em中&gt;媒介一過性タンパク質産生<em&gt;タバコ</em

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short ...

A Comparative Analysis of Recombinant Protein Expression in Different Biofactories: Bacteria, Insect Cells and Plant Systems

Plant-based systems are considered a valuable platform for the production of recombinant proteins as a result of their well-documented potential for the flexible, low-cost production of high-quality, bioactive products.
In this study, we compared the expression of a target human recombinant protein in traditional fermenter-based cell cultures (bacterial and insect) with plant-based expression systems, both transient and stable.
For each platform, we described the set-up, optimization and length of the production process, the final product quality and the yields and we evaluated provisional production costs, specific for the selected target recombinant protein.
Overall, our results indicate that bacteria are unsuitable for the production of the target protein due to its accumulation within insoluble inclusion bodies. On the other hand, plant-based systems are versatile platforms that allow the production of the selected protein at lower-costs than Baculovirus/insect cell system. In particular, stable transgenic lines displayed the highest-yield of the final product and transient expressing plants the fastest process development. However, not all recombinant proteins may benefit from plant-based systems but the best production platform should be determined empirically with a case-by-case approach, as described here.

In this study the expression of a target human recombinant protein in different production platforms was compared. We focused on traditional fermenter-based cultures and on plants, describing the set-up of each system and highlighting, on the basis of the reported results, the inherent limits and advantages for each platform.

細菌、昆虫細胞およびプラントシステムズ：異なるバイオファクトリーでの組換えタンパク質発現の比較分析

Plant-based systems are considered a valuable platform for the production of recombinant proteins as a result of their well-documented potential for the ...

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

Protein-protein interactions are fundamental mechanisms for relaying signal transduction in most cellular processes; therefore, identification of novel protein-protein interaction pairs and monitoring protein interaction dynamics are of particular interest for revealing how plants respond to environmental factors and/or developmental signals. A plethora of approaches have been developed to examine protein-protein interactions, either in vitro or in vivo. Among them, the recently established luciferase complementation imaging (LCI) assay is the simplest and fastest method for demonstrating in vivo protein-protein interactions. In this assay, protein A or protein B is fused with the amino-terminal or carboxyl-terminal half of luciferase, respectively. When protein A interacts with protein B, the two halves of luciferase will be reconstituted to form a functional and active luciferase enzyme. Luciferase activity can be recorded with a luminometer or CCD-camera. Compared with other approaches, the LCI assay shows protein-protein interactions both qualitatively and quantitatively. Agrobacterium infiltration in Nicotiana benthamiana leaves is a widely used system for transient protein expression. With the combination of LCI and transient expression, these approaches show that the physical interaction between COP1 and SPA1 was gradually reduced after jasmonate treatment.

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

This manuscript describes an easy and rapid experimental procedure for determining protein-protein interactions based on the measurement of luciferase activity.

ベンサミアーナ タバコ葉蛋白質蛋白質の相互作用ダイナミクスの一過性の決定のための試金補完ルシフェラーゼ イメージング

Protein-protein interactions are fundamental mechanisms for relaying signal transduction in most cellular processes; therefore, identification of novel ...

Production of IgG Fusion Proteins Transiently Expressed in Nicotiana benthamiana

High demand for antibodies as therapeutic interventions for various infectious, metabolic, autoimmune, neoplastic, and other diseases creates a growing need in developing efficient methods for recombinant antibody production. As of 2019, there were more than 70 FDA-approved monoclonal antibodies, and there is exponential growth potential. Despite their promise, limiting factors for widespread use are manufacturing costs and complexity. Potentially, plants offer low-cost, safe, and easily scalable protein manufacturing&#160;strategies. Plants like Nicotiana benthamiana not only can correctly fold and assemble complex mammalian proteins but also can add critical post-translational modifications similar to those offered by mammalian cell cultures. In this work, by using native GFP and an acid-stable variant of green fluorescent protein (GFP) fused to human monoclonal antibodies, we were able to visualize the entire transient antibody expression and purification process from N. benthamiana plants. Depending on the experiment&#39;s purpose, native GFP fusion can ensure easier visualization during the expression phase in the plants, while acid-stable GFP fusion allows for visualization during downstream processing. This scalable and straightforward procedure can be performed by a single researcher to produce milligram quantities of highly pure antibody or antibody fusion proteins in a matter of days using only a few small plants. Such a technique can be extended to the visualization of any type of antibody purification process and potentially many other proteins, both in plant and other expression systems. Moreover, these techniques can benefit virtual instructions and be executed in a teaching laboratory by undergraduate students possessing minimal prior experience with molecular biology techniques, providing a foundation for project-based exploration with real-world applications.

Production of IgG Fusion Proteins Transiently Expressed in Nicotiana benthamiana

We describe here a simple method for expression, extraction, and purification of recombinant human IgG fused to GFP in Nicotiana benthamiana. This protocol can be extended to purification and visualization of numerous proteins that utilize column chromatography. Moreover, the protocol is adaptable to the in-person and virtual college teaching laboratory, providing project-based exploration.

ニコティアナ・ベンタミアナで一過性発現するIgG融合タンパク質の製造

High demand for antibodies as therapeutic interventions for various infectious, metabolic, autoimmune, neoplastic, and other diseases creates a growing ...

N. benthamianaの葉からのGFP-Hisの効率的な抽出と精製

Apoplast-Extraction Based Method to Improve the Purity of Plant Produced Recombinant Protein

Plants are a newly developing eukaryotic expression system being explored to produce therapeutic proteins. Purification of recombinant proteins from plants is one of the most critical steps in the production process. Typically, proteins were purified from total soluble proteins (TSP), and the presence of miscellaneous intracellular proteins and cytochromes poses challenges for subsequent protein purification steps. Moreover, most therapeutic proteins like antigens and antibodies are secreted to obtain proper glycosylation, and the presence of incompletely modified proteins leads to inconsistent antigen or antibody structures. This work introduces a more effective method to obtain highly purified recombinant proteins from the plant apoplastic space. The recombinant Green fluorescent protein (GFP) is engineered to be secreted into the apoplast of Nicotiana benthamiana and is then extracted using an infiltration-centrifugation method. The GFP-His from the extracted apoplast is then purified by nickel affinity chromatography. In contrast to the traditional methods from TSP, purification from the apoplast produces highly purified recombinant proteins. This represents an important technological improvement for plant production systems.

著者スポットライト:植物細胞からの組換えタンパク質の効率的な回収のためのアポプラストタンパク質抽出の最適化

The purification of recombinant proteins from plant systems is usually challenged by plant proteins. This work provides a method to effectively extract and purify a secreted recombinant protein from the apoplast of Nicotiana benthamiana.

アポプラスト抽出法による植物産生組換えタンパク質の純度向上  

Plants are a newly developing eukaryotic expression system being explored to produce therapeutic proteins. Purification of recombinant proteins from ...

一過性発現タバコにおける葉トリテルペン用分取スケールで

要約

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ギブソンアセンブリと遺伝子銃を用いてタバコの一過性の遺伝子発現

組換えセルラーゼCEL5Aの式から

にバインドされた熱安定、発現、精製、およびヒトセロトニントランスポーターの結晶化

ジテルペノイド天然物の酵素生産と精製のためのカスタマイズ可能なアプローチ

組換えタンパク質の高レベルの一過性発現のための植物の効率的なアグロ

最適化と利用の

細菌、昆虫細胞およびプラントシステムズ：異なるバイオファクトリーでの組換えタンパク質発現の比較分析

ベンサミアーナタバコ葉蛋白質蛋白質の相互作用ダイナミクスの一過性の決定のための試金補完ルシフェラーゼイメージング

ニコティアナ・ベンタミアナで一過性発現するIgG融合タンパク質の製造

アポプラスト抽出法による植物産生組換えタンパク質の純度向上

一過性発現タバコにおける葉トリテルペン用分取スケールで

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ギブソンアセンブリと遺伝子銃を用いてタバコの一過性の遺伝子発現

組換えセルラーゼCEL5Aの式から

にバインドされた熱安定、発現、精製、およびヒトセロトニントランスポーターの結晶化

ジテルペノイド天然物の酵素生産と精製のためのカスタマイズ可能なアプローチ

組換えタンパク質の高レベルの一過性発現のための植物の効率的なアグロ

最適化と利用の

細菌、昆虫細胞およびプラントシステムズ：異なるバイオファクトリーでの組換えタンパク質発現の比較分析

ベンサミアーナ タバコ葉蛋白質蛋白質の相互作用ダイナミクスの一過性の決定のための試金補完ルシフェラーゼ イメージング

ニコティアナ・ベンタミアナで一過性発現するIgG融合タンパク質の製造

アポプラスト抽出法による植物産生組換えタンパク質の純度向上

ベンサミアーナタバコ葉蛋白質蛋白質の相互作用ダイナミクスの一過性の決定のための試金補完ルシフェラーゼイメージング