ペルオキシソームはベータ酸化を行い、ROS損傷を受けやすい。この方法は、細胞がROSストレスペルオキシソームをどのように扱うかを調べることを可能にする。このプロトコルは、細胞集団内のすべてのペルオキシソームをグローバルに標的化するために使用されるだけでなく、単一細胞内の個々のペルオキシソームの操作を可能にすることもできます。
色素支援ROS生成は、ペルオキシソーム以外の細胞小器官を標的にして、細胞が細胞小器官損傷にどのように対処するかを調べるためにも使用できます。まず、直径20ミリメートルのガラスマイクロウェルを備えたガラス底の35ミリメートル培養皿に、840マイクロリットルの培養液に10から5番目のヒトSHSY5Y細胞を2倍、または4番目のマウスNIH H3T3細胞に10の6倍を播種します。5%下で細胞を摂氏37度で24時間増殖させます。
次に、トランスフェクション試薬またはSHSY5Y細胞トランスフェクションを用いて、細胞を目的のプラスミドでトランスフェクションします。プラスミドを55マイクロリットルの無血清DMEM/F-12で希釈し、1マイクロリットルのトランスフェクション試薬を55マイクロリットルの無血清DMEM/F-12で希釈します。希釈したDNAを希釈試薬と組み合わせます。
穏やかに混合し、室温で30分間インキュベートします。抗生物質を含まないSHSY5Y細胞を含む100マイクロリットルの培養液で予め播種した20ミリメートルのマイクロウェルに複合体を追加します。皿を前後にそっと振る。
前述のようにNIH 3T3細胞トランスフェクションを実行しますが、プラスミド希釈およびトランスフェクション試薬には、無血清DMEM/F-12の代わりに還元血清培地を使用してください。2時間のトランスフェクション後、トランスフェクション試薬含有培地を取り出し、1ミリリットルの新しい培養培地を加えます。NIH 3T3またはSHSY5Y細胞を摂氏37度、二酸化炭素5%で24時間インキュベートします。
光活性化ROS産生の場合、トランスフェクション後24時間で培地を除去し、10マイクロリットルの200ナノモルHaloTag TMRリガンドまたは200ナノモルのJanelia Fluor 646 HaloTagリガンドを20ミリメートルのガラスマイクロウェルに加えます。皿を摂氏37度と5%の二酸化炭素インキュベーターに移し、細胞を染色するために1時間放置します。1時間後、染色培地を完全に除去し、1ミリリットルの新鮮な培養培地を加えます。
目的の細胞を含むガラス底皿を、ステージトップインキュベーターを備えたレーザー走査型共焦点顕微鏡上に置きます。ソフトウェアで、[ツールウィンドウ]をクリックし、[接眼レンズ]を選択し、[DIA]ボタンをクリックして透過光をオンにします。顕微鏡の接眼レンズを通して皿を見て、フォーカスノブを回して細胞に焦点を合わせます。
LSMを選択し、色素検出器選択ボタンをクリックします。ポップアップウィンドウで目的の色素をダブルクリックして、細胞をイメージングするための適切なレーザーとフィルターの設定を選択します。ライブパネルのLive4xをクリックして高速レーザースキャンを開始し、細胞の蛍光シグナルのスクリーニングを開始します。
ジョイスティックコントローラーを使用してステージを移動し、培地のdiKillerRed VKSKLまたはSLP-VKSKL発現細胞を見つけて、ペルオキシソームにROSストレスを適用します。目的のセルの画像を取得します。ツールウィンドウをクリックし、LSM刺激を選択します。
次に、楕円ボタンをクリックし、ライブ画像ウィンドウでマウスを使用して、ROSストレスが適用される目的のペルオキシソームを含む直径15マイクロメートルのROIを描画します。ROSストレスを適用するには、diKillerRed VKSKLまたはTMR標識SLPリガンドを有する細胞には561ナノメートルを使用し、Janelia Fluor 646標識SLPリガンドで染色された細胞には640ナノメートルを使用します。ROSストレスを適用するレーザー波長を選択します。
希望のレーザーのパーセンテージと持続時間を入力します。ペルオキシソームでのROS産生については、[取得]、[刺激]ボタンの順にクリックして、ROIを介して561ナノメートルまたは640ナノメートルの光でそれぞれ30秒間スキャンを開始します。この刺激は、561ナノメートルと640ナノメートルの約5%レーザー出力設定に相当します。
レーザー照射の30秒後、ROI内のペルオキシソームは、ジキラーレッドVKSKL、TMR、またはジャネリアフルーア646シグナルを失います。このシグナル損失により、細胞内の照らされたペルオキシソームと照らされていないペルオキシソームを区別することができます。ペキソファージ生細胞をモニタリングするには、EGFPタグ付きStub1、Hsp70、ユビキチン、p62、またはLC3Bの、照明付きペルオキシソームまたはROSストレスペルオキシソームへの転座を、フレーム間に10分間隔でタイムラプスイメージングして追跡します。
焦点照明は、蛍光レポーターroGFP2-VKSKLによって示されるように、個々のペルオキシソーム内で瞬間的かつ局所的なROS産生をもたらす。diKillerRed VKSKL画像は、損傷したペルオキシソームの位置を示すためにすべてのroGFP2-VKSKL測定が行われた後に撮影されました。データはまた、照射されていないペルオキシソームが影響を受けないことを示しており、方法論の精度を示しています。
この方法論は、Stub1を介したペキソファジーを監視するために使用されました。このプロセスの間、Hsp70、Stub1、ユビキチン化タンパク質、オートファジーアダプターp62およびLC3Bが続いてROSストレスペルオキシソームに現れ、ペキソファジーを駆動します。同じ戦略を使用して、Stub1を介したペキソファジーの生化学的特性評価のために、培養皿上のすべてのペルオキシソームを同時に損傷させることができました。
LED照明前は、EGFP-ユビキチン蛍光は細胞質内で均一であり、ペルオキシソームと共局在しませんでした。9時間のLED照明の後、EGFP-ユビキチンシグナルは、共焦点皿で増殖した細胞内のすべてのペルオキシソームに蓄積しました。このプロトコルを使用して、ROSストレスペルオキシソームがユビキチン依存性の分解経路を介して除去されることを発見しました。
ROSストレスペルオキシソームは、ユビキチンE3リガーゼStub1をリクルートして、ペキソファジーによる除去を可能にします。
