環境保護や研究のための研究所のLoredana Manfra（環境品質監視のイスプラ·専攻）と環境保護のための地域機関（エミリアロマーニャ、イタリア）のフェデリカSavorelliによって生成された。 生物学的方法グループ内のアルテミア甲殻類のサブワーキンググループのリファレンスメンバー-水の品質に及ぼす塩水/ UNICHIM委員会の汽水と土砂（化学部門の技術標準オペレーティング·システム用の研究所）。 イスプラのマルコPisapia（Webユニット）によるビデオ撮影と編集。 アンナ·マリア·キケロとイスプラのエリカMagaletti（環境品質監視科）による生産調整。 海水/汽水 - 私たちは、エミリアロマーニャの環境保護、フェラーラ支店、生物学的方法グループの地域の代理店に感謝したいと思いますロセラボスコロとその財政支援のためのイスプラのマッシモGabellini（予防と影響の緩和科）;ファビオMatassaとロンドンの水質とルチアナミリオレ、彼らの協力のためのイビストルヴェルガータ大学（ローマ）のUNICHIM委員会の水と土砂彼らの言語サポートのためにローマの言語の学校。

1。メソッドは、標準我々のテストは、14日間暴露し、定義された条件を満たす生物の50％（LC 50）の死を引き起こす濃度または希釈濃度を決定する目的のために物質濃度や試験サンプルの間隔にアルテミア幼生を公開することが含まれこの方法による。必要かつ可能であれば、以下も決定することができる。）露出した生物の20％（LC 20）の死を引き起こす濃度レベルと、b）のそれよりも高い死亡率を決定するものではありません最高の分析濃度レベルネガティブコントロール（NOEC）、14日後に、決定する最低試験濃度レベル、ネガティブコントロール（LOEC）のそれよりも高い死亡率。 2。材料試験 2.1 アルテミアの卵テストを実行するには、 アルテミアfranciscana </em古い48時間未満の&gt;幼虫は（ノープリウス）が新たに孵化した卵5から得られた、ステージIIまたはIIIで、要求されます。テストをサポートするために利用認定卵や嚢胞は品質保証研究部門、米国環境保護庁、シンシナティOH 45268、米国や水生汚染の生物学的研究のための研究所から、ゲント大学、ベルギー、例えば、市販されている。 2.2水の希釈合成塩水が認識され、分析品質の試薬または蒸留水または脱イオン水に市販の製剤を溶解して調製し、希釈水として使用することができます。理想的な海水を作成するための塩のブレンドは、 インスタントオーシャン混合物を 、例えば、市販されている。それは35（±2）に等しい塩分希釈水をお勧めしますPSUと同様に彩度の値の80％以上の溶存酸素濃度と温度25（±2）＆度、C. 48時間、少なくとも0.45μmの多孔度を有するフィルターでろ過するための曝気した後、希釈は0〜4℃の温度で、暗所で、最大30日間保存することができる 2.3藻類の培養 2.0x10 6細胞/ mlに-それは、試験生物は、指数関数的に成長し、1.3×10 6の密度に達するDunaliella tertiolecta微細藻類を餌であることをお勧めします。環境サンプルのテストは、2.0x10 6細胞/ mlの6より高い密度の文化を必要とします。それは（30（±2）PSU、20（±1）℃）Dunaliella tertiolectaは、海水を含む培養培地中で成長することが示唆された必須栄養素、ミネラル、ビタミンを加えた。藻類の培地組成と準備に関するいくつかの兆候は、付録に報告されています。初期細胞密度は約10 5細胞/ mlであることが示唆されています。藻類の培養は、内に保持され20部屋のサーモスタット（±1）℃、蛍光灯3000（±300）LX、闇の8時間に光の16時間の光周期比で照らさ。 他の植物プランクトン種が、また給紙を使用することができるが、それはDunaliella tertiolectaに&quot;同等&quot;の種を見つけるために、これらの植物プランクトン種との比較研究を行うことが必要となるため、実験条件（例えば、初期細胞密度、光照射、温度、組成物培地と露光時間）は、植物プランクトンの種によって異なります。別の汚染物質への耐性微細藻類のほかにも、 アルテミアへの植物プランクトンへの影響の成長と発展に汚染物質の影響するため考慮する必要があります。 2.4参照物質このテストでは、参照物質は、ドデシル硫酸ナトリウムです。 2.5実験室ガラス製品<ol><li> 100ミリリットルホウケイ酸ガラスビーカー（18ソリューションを転送するためのテストと18を実行する）を含むテストコンテナ。 </li><li>標準溶液を調製するためのフラスコ（500 mlフラスコ）。 </li><li>試験溶液を調製するための6つのフラスコ（例えば、200 mlのフラスコ）。 </li><li>嚢胞を活性化し、孵化皿からテストコンテナにアルテミアを転送するために使用される取り外し可能なカバー付きガラスやポリスチレン5cmの直径ペトリ皿。 </li><li>ノープリウスを転送するためのガラスパスツールピペット（炎で丸めヒント付き）。 </li><li>ガラスカニューレまたはアルテミアを転送するためのパスツールピペット3ミリリットル使い捨てのプラスチックピペット（カットする）。 </li><li>試験溶液を調製するためにマイクロピペットとメスピペット。 </li><li>フラスコからtにテストソリューションを転送するための6つのメスシリンダー（例えば、50mlのシリンダ）彼はコンテナをテストする。 </li></ol> 3。嚢胞のアクティベーション 3.1。嚢胞+注ぐ水を含むペトリ皿試験生物を生成するには、嚢胞の20 mgを48時間テストの前に希釈水12ミリリットルを含むペトリ皿に置かれます。 3.2。光の中で、暗所でインキュベーションペトリ皿は、一時間のために25（±2）℃、4000（±1000）ルクス（平方メートルあたりのルーメン）の光強度で維持されます。 3.3。顕微鏡を用いて培地を交換する 24時間後、孵化幼虫は人工的な水で満たされた新しいペトリ皿に転送されます。転送が孵化、屈光性幼虫は、光ビームに向かって移動するように、すなわち光源を使用して、顕微鏡を使用して行われます。ガラスパスツールピペットは、その唯一の新生幼虫がARを確保するため、転送を行うために使用されますeが膜に残って嚢胞や幼虫を転送しません。 3.4。暗闇の中でインキュベーション幼虫を含んだ料理は25℃で24時間、暗所恒温槽（±2）℃に置かれ 4。試験溶液の調製 4.1。物質+フラスコへの転送を量るそれは、テスト物質の標準溶液を500 mlのフラスコ中の物質0.5gを溶解して調製することをお勧めします。フラスコを脱イオン水または蒸留水を充填されており、試験物質が完全に溶解するまで溶液を攪拌されています。ソリューションは、それは物質が溶液中で安定しているかどうかは知られていない限り、使用時に準備する必要があります。その場合には、標準溶液は、試験前に2日以内に調製することができる。 4.2。希釈水と藻wiを追加して、ネガティブコントロールの準備10ミリリットルピペット番目ネガティブコントロールは、10 5細胞/ mlの密度が得られるように希釈水に藻類懸濁液の一部を追加することにより、フラスコ（例えば200ミリリットルの容積）で調製されています。 4.3。テストソリューションの準備：希釈水、藻類及び標準溶液を加えるそれは、テストソリューションは、テストのための所望の濃度が得られるように指定した量の希釈水に標準溶液を添加することにより5 200ミリリットルのフラスコで調製されることをお勧めします。生物を養うために、Dunaliella tertiolecta微細藻類懸濁液のアリコートを、テスト·ソリューションが用意されて10 5細胞/ mlの密度に到達するために使用して追加することができます。また、次の順序が推奨されます。希釈水、藻類懸濁液および標準のソリューションを提供します。試験溶液の調製後、彼らはできるだけ早くアッセイに使用する必要があります。 4.4。フラスコからテストコンテナには、ペトリ皿に移すソリューションテストソリューションの等量（50ml）をメスシリンダーを利用した試験容器に導入されています。各濃度の3つのレプリカが作られています。テストの各シリーズでは、コントロールコンテナは、テスト·ソリューションの体積に等しい希釈水の量で用意されています。試験溶液の等量（約12 ml）をペトリ皿に導入される。テストの各シリーズでは、コントロールのペトリ皿を使用しています。 5。テストの準備 5.1。 II-IIIの段階でノープリウス嚢胞のアクティベーション48時間後、ノープリウスは、II-III幼虫の段階に到達してから、テストのために使用できます。 5.2。顕微鏡を用いてペトリ皿にノープリウス転送嚢胞に使用されるペトリ皿<html>活性化は、恒温槽から取り出しています。幼虫は少量の制御とテストソリューションを含むペトリ皿に転送されます。このタスクでは、生物が破損しないように十分に広い直径のピペットを利用した顕微鏡で実行されることになっている。テストのこのフェーズでは、転送がガラスパスツールピペット（炎で丸め先端）と集計するアルテミアを奨励して横方向に配置されたライトソースで実行されるかもしれません。 5.3。顕微鏡を使用してテストコンテナへのペトリ皿からノープリウス転送十幼虫は、テストソリューションのペトリ皿からテストコンテナに転送されます。また、この操作は、パスツールピペットや顕微鏡を利用することによって実行する必要があります。それは1 mLを超えないボリュームは、テスト·システム全体の音量に影響を与えない幼虫の通過中に転送されることをお勧めします。 パラフィルムで覆われてe_step &quot;&gt; 5.4。フルコンテナテストのビーカーをパラフィルム（空気通路のギャップを残して）で覆われ、25℃の温度で維持されている（±2）℃試験の全期間、900の照明で（±100）日長とLX暗闇の10時間への光の14時間の比率。 6。ミディアムとフードサプリメントを交換する 6.1。生存率の制御テストが開始された二日後、その5、7、9、12日後に、 アルテミアは、生存率を確認し、培地と栄養補助食品を置き換えるために顕微鏡下で観察されています。 生菌数は、各試験容器内にカウントされます。顕微鏡下で観察し、わずかに機械的刺激後（ガラスパスツールピペットで幼虫を触るなど）約10秒のためのいくつかの動きを表示しない生物econdsは死んだと見なされるべきである。 6.2。マイクロピペットを使用してテストする物質の10 mlのピ​​ペットとサンプリングと藻類のサンプリングを示す試験溶液の調製。フラスコからテストコンテナへの転送ソリューションテスト中、テストソリューションは、定期的に交換し、それらが使用されるのと同じ日に準備する必要があります。試験溶液を予め調製した標準溶液から作られています。 つの新しいコンテナに古いテストコンテナから6.3。 アルテミア転送 、カットパスツールピペットを利用して、 アルテミアの転送は、そのような生物を傷つけないように十分に広い直径をピペットを用いて行われる。このフェーズでは、3ミリリットルプラスチック製パスツールピペットは（カットする）を使用することができます。 6.4。ライブまたは死んだアルテミアを含むビーカーの幼虫 1の後<html>テストの終わりに露出の4日間は、幼虫の生存数をカウントし、ワークシートに記録されます。 14日目のLC 50および/ ​​またはLC 20、NOECおよびLOECは、計算されたと記録されたほか、95％信頼限界を必要に応じて、計算方法をされています。 7。代表的な結果テスト（14日）の終わりには、次の式に従って、各濃度での死亡率の割合を計算します。 （M、S / N）* 100 ここで、 M sは 、分析試料中に死亡した個体数の平均値です Nは、曝露した人の総数です。 表1レポートドデシル硫酸ナトリウムにさらされたアルテミアとテスト（14D）のデータの例を。 <table border="1"><tbody><tr><td> 濃度（mg / l）の </td>各レプリカで死亡した個人の &quot;&gt; 数 </td><td> 死亡率（％） </td></tr><tr><td></td><td> 私は </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td></td></tr><tr><td> 負の制御 </td><td> 0 </td><td> 2 </td><td> 1 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> 1.56 </td><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 0 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> 3.12 </td><td> 2 </td><td> 0 </td><td> 2 </td><td> 13 </td></tr><tr><td> 6.25 </td><td> 3 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 27 </td></tr><tr><td> 12.5 </td><td> 8 </td><td> 9 </td><td> 10 </td><td> 90 </td></tr><tr><td> 25.0 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> 50.0 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 100 </td></tr></tbody></table>また、決定するグラフィカルガウス対数プロットするか、適切な統計的手法（例えばスピアマン-Karberまたはプロビット法）を用いてLC 50値を返します。表1のデータのためのLC 50の計算は、8.18（7.15から9.37）mg / Lである。最大濃度は50％の低死亡率の原因となった試験を行った場合、あなたは、信頼できない、あるいは非計算になるLC 50値の計算に進むべきではありません。ただし、この場合、試験濃度の範囲を拡張することにより、テストを繰り返すことが適切であろう。また、LC 50値はより正確に最高濃度よりも大きいように表現されている可能性が試験した最高濃度と効果なしに対応した最高濃度で死亡率の割合を示す、テストされています。 以下の条件をテストの終了時に満たされている場合、結果は有効とみなされています。 <ol class="lalpha"><li>コントロールの平均死亡率≤20％です。 </li><li>ドデシル硫酸ナトリウムを使用して、どこに、14日間のLC 50は 8.0（±5）mg / lの区間に含まれています。 </li></ol>上記の条件が満たされていない場合、生物の同じバッチで得られたすべてのデータは無効と見なされ、テストは繰り返されるべきである。

<ol>
	<li>Togulga, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Short-Term+Toxicity+of+Two+Toxicants+to+Artemia+Nauplii.">The Short-Term Toxicity of Two Toxicants to Artemia Nauplii.</a> Tr. J. of Zoology. 22, 259-266 (1998).</li><li>Persoone, G., Wells, P. G., Sorgeloos, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artemia+in+aquatic+toxicology:+a+review.">Artemia in aquatic toxicology: a review.</a> Artemia Research and its Applications. Morphology, Genetics, Strain characterization Toxicology. , 259-275 (1987).</li><li>Nunes, B. S., Carvalho, F. D., Guilhermino, L. M., Stappen, G. V. a. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+genus+Artemia+in+ecotoxicity+testing.">Use of the genus Artemia in ecotoxicity testing.</a> Envir. Poll. 144, 453-462 (2006).</li><li>APAT IRSA-CNR. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Metodi analitici per le acque Manuali e Linee guida 29/2003. Terzo Metodo, 8060 (2003).</li><li>Sorgellos, P., Wielen, C. R. e. m. i. c. h. e. -. V. a. n. D. e. r., Persoone, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+Artemia+nauplii+for+toxicity+tests+â€“+a+critical+analysis.">The use of Artemia nauplii for toxicity tests â€“ a critical analysis.</a> Ecotox. Env. Saf. 2, 249-255 (1978).</li><li>Savorelli, F., Palazzi, D., Gorbi, G., Invidia, M., Sei, S., Magaletti, E., Manfra, L., Gelli, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Set+up+of+a+standard+methodology+for+14-day+bioassay+on+Artemia+franciscana+and+A.+parthenogenetica.">Set up of a standard methodology for 14-day bioassay on Artemia franciscana and A. parthenogenetica.</a> Biol. Amb. 21, 27-36 (2007).</li><li>Brix, K. V., Cardwell, R. D., Adams, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+toxicity+of+arsenic+to+the+Great+Salt+Lake+brine+shrimp,+Artemia+franciscana.">Chronic toxicity of arsenic to the Great Salt Lake brine shrimp, Artemia franciscana.</a> Ecotox. Environ. Saf. 54, 169-175 (2003).</li><li>Brix, K. V., Deforest, D. K., Cardwell, R. D., Adams, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+a+chronic+site-specific+water+quality+standard+for+selenium+in+the+Great+Salt+Lake,+Utah,+USA.">Derivation of a chronic site-specific water quality standard for selenium in the Great Salt Lake, Utah, USA.</a> Environ. Toxicol. Chem. 23, 606-612 (2004).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Qualit&#225;+dell'acqua+-+Determinazione+della+tossicit&#225;+letale+a+14+giorni+con+Artemia+franciscana+(Crustacea:+Anostraca).">Qualit&#225; dell'acqua - Determinazione della tossicit&#225; letale a 14 giorni con Artemia franciscana (Crustacea: Anostraca).</a> Commissione UNICHIM "Qualit&#225; dell'acqua" Gruppo di Lavoro "Metodi Biologici" Sottogruppo "Acque salate/salmastre e sedimenti". , (2010).</li><li>Varo, I., Navarro, J. C., Amat, F., Guilhermino, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+cholinesterases+and+evaluation+of+the+inhibitory+potential+of+chlorpyrifos+and+dichlorvos+to+Artemia+salina+and+Artemia+parthenogenetica.">Characterisation of cholinesterases and evaluation of the inhibitory potential of chlorpyrifos and dichlorvos to Artemia salina and Artemia parthenogenetica.</a> Chem. 48, 563-569 (2002).</li></ol>

利害の衝突が宣言されません。

アルテミアは、私たちは、それが毒性毒性学におけるアルテミアの使用に関連するいくつかのオプションを維持することが可能であることを明記することができ、これまで行わ生態毒性試験および研究のために利用できる最も貴重な試験生物の一つです。バイオアッセイに適した種にこの生物をオン特性は次のとおりです。広い地理的分布、不利な環境条件と様々な栄養素を、...

環境保護や研究のための研究所のLoredana Manfra（環境品質監視のイスプラ·専攻）と環境保護のための地域機関（エミリアロマーニャ、イタリア）のフェデリカSavorelliによって生成された。 生物学的方法グループ内のアルテミア甲殻類のサブワーキンググループのリファレンスメンバー-水の品質に及ぼす塩水/ UNICHIM委員会の汽水と土砂（化学部門の技術標準オペレーティング·システム用の研究所）。 イスプラのマルコPisapia（サイエンティフィック·アドバイザリーおよびドキュメント·サービス）によるビデオ撮影と編集。 アンナ·マリア·キケロとイスプラのエリカMagaletti（環境品質監視科）による生産調整。 我々は、エミリアロマーニャ、フェラーラ支店とBiologの環境保護のための地域機関に感謝したいと思いますiCalのメソッドグループ - 海水/汽水とその協力のための水の品質に及ぼすUNICHIM委員会の土砂、ロセラボスコロとその財政支援のためのイスプラのマッシモGabellini（予防と影響の緩和学科）、ローマの言語のロンドン·スクール彼らの言語サポートのために。 <table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> 製品番号 </td></tr><tr><td>ドデシル硫酸ナトリウム</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> L4390 </td></tr></tbody></table>付録藻類のメディアは、分析品質の試薬を用いて調製する必要があります。 栄養溶液のリットルのNaNO 3、蒸留水のNH 4 ClのKH 2 PO 4と20グラムの30グラムの300グラムに溶解して調製されています。 最初は、以下の4つのソリューション（A、B、C、D鉱物の）は以下のように調製されています。 <ul><li>溶液1リットル&quot;&quot;のCuSO 4の硫酸亜鉛4 H 2 O、25グラム5 H 2 O、COSO 4 7 H 2 O 30gを蒸留水でのMnSO 4 H 2 Oの20グラムの30グラムを含んでいる。 </li><li>溶液1リットルの蒸留水にFeCl 3を •6 H 2 Oの50グラムを含んで&quot;B&quot;; </li><li>溶液1リットルの蒸留水中のNa 2たMoO 4•2 H 2 Oの25グラムを含んでいる&quot;C&quot;; </li><li> 50グラムディのNa 2 EDTAを含む溶液を&quot;D&quot;蒸留水で•2 H 2 Oリットル。 </li></ul>鉱物（ソリューション &quot;E&quot;）の最終的な溶液1リットルの蒸留水に、上記のソリューションのアリコートを添加し得られます。また、次の順序が推奨されます。ソリューション &quot;D&quot;の100ミリリットル、溶液10ml &quot;C&quot;、ソリューション &quot;B&quot;の10mlと溶液10ml &quot;&quot;。 三のイニシアティブビタミンlのソリューション（F、G、H）は以下のように調製されています。 <ul><li>溶液1リットルの蒸留水でビオチン100mgを含む &quot;F&quot;; </li><li>蒸留水でチアミンの10グラムを含む溶液1リットル &quot;G&quot;; </li><li>蒸留水でコバラミンの100mgを含有する溶液を &quot;H&quot;リットル。 </li></ul>ビタミン（ソリューション &quot;I&quot;）の最終的な溶液1リットルの蒸留水の3つの初期解の10ミリリットルを添加し得られます。 藻類のメディアリットルの培養液、ミネラル最終的な解決策（ソリューション &quot;E&quot;）と海水中のビタミン最終的な解決策（ソリューション &quot;I&quot;）1 mlの1 mlの1mlを溶解して調製されています。この後者は認知されている分析品質の試薬または蒸留水または脱イオン水に市販の製剤を溶解することによって得ることができる。理想的な海水を作成するための塩のブレンドは、 インスタントオーシャン混合物を 、例えば、市販されている。それはrecommenです。30（±2）PSUと温度20（±1）℃の塩分と海水の使用DED

long-term lethal toxicity test with the crustacean artemia franciscana

我々の研究活動は、海水/汽水と堆積物への特定を参照して、環境の質の評価のための生物学的方法の使用を対象としています。生物学的指標の選択は、標準化された手順の可用性に、おそらく、信頼できる科学的知見に基づいてしなければなりません。本稿では、化学物質、および/ ​​または海洋環境の行列の毒性を評価するために、海洋甲殻類のブラインシュリンプを使用した標準化されたプロトコルを提示します。科学者たちは、ブラインシュリンプ（ アルテミア ） は世界的に利用するための標準アッセイの開発に適した候補であることを提案する。論文の数は、ブラインシュリンプ（ アルテミア ）の様々な化学物質や有害物質の毒性に公開されています。毒性研究のためのこの甲殻類の主な利点は、乾燥した嚢胞の全体的な可用性であり、これらはすぐにテストで使用することができ、困難な栽培が求められていません<suP&gt; 1,2。嚢胞ベース毒性アッセイは、継続的に、利用可能な、シンプルで信頼性の高い安価であるため、工業用監視の要件については、または規制上の目的3の毒性スクリーニングのルーチンニーズに重要な答えです。提案手法は、エンドポイントとして死亡率を伴う。生存者の数を数えたと死亡の割合を算出した。彼らが観察4の数秒の間に、任意の内部または外部の動きを示さなかった場合は、幼虫が死んだと考えられた。このプロシージャは、参照物質（ドデシル硫酸ナトリウム）標準化されたテストであった。いくつかの結果がこの仕事に報告されています。この資料では、プロトコルに関連するすべての手順を示す、手続きの毒性試験の性能を説明するビデオが付属しています。

Watch this Scientific Journal Video about Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana at JoVE.com

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

本研究では、化学物質、産業廃水や下水と海水甲殻類の液体環境試料によって発揮される長期的（14日）致死毒性を決定するための貴重な方法論的なプロトコルの開発と標準化にかかわる<em&gt;アルテミアfranciscana</em&gt;。

甲殻類との長期致死毒性試験アルテミアfranciscana</em

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish ...

long-term-lethal-toxicity-test-with-the-crustacean-artemia-franciscana

Research

JoVE Journal

Biology

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

19.4K ビュー.  Institute for Environmental Protection and Research. 本研究では、化学物質、産業廃水や下水と海水甲殻類の液体環境試料によって発揮される長期的（14日）致死毒性を決定するための貴重な方法論的なプロトコルの開発と標準化にかかわるアルテミアfranciscana。

ビデオ: Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Long-term Imaging Mammalian Cells using Wide-Field Microscopy

広視野顕微鏡を用いて長期的なイメージング哺乳類細胞

生物学

Long-term Culture of Human Breast Cancer Specimens and Their Analysis Using Optical Projection Tomography

Breast cancer is a leading cause of mortality in the Western world. It is well established that the spread of breast cancer, first locally and later distally, is a major factor in patient prognosis. Experimental systems of breast cancer rely on cell lines usually derived from primary tumours or pleural effusions. Two major obstacles hinder this research: (i) some known sub-types of breast cancers (notably poor prognosis luminal B tumours) are not represented within current line collections; (ii) the influence of the tumour microenvironment is not usually taken into account.
We demonstrate a technique to culture primary breast cancer specimens of all sub-types. This is achieved by using three-dimensional (3D) culture system in which small pieces of tumour are embedded in soft rat collagen I cushions. Within 2-3 weeks, the tumour cells spread into the collagen and form various structures similar to those observed in human tumours1. Viable adipocytes, epithelial cells and fibroblasts within the original core were evident on histology. Malignant epithelial cells with squamoid morphology were demonstrated invading into the surrounding collagen. Nuclear pleomorphism was evident within these cells, along with mitotic figures and apoptotic bodies.
We have employed Optical Projection Tomography (OPT), a 3D imaging technology, in order to quantify the extent of tumour spread in culture. We have used OPT to measure the bulk volume of the tumour culture, a parameter routinely measured during the neo-adjuvant treatment of breast cancer patients to assess response to drug therapy. 
Here, we present an opportunity to culture human breast tumours without sub-type bias and quantify the spread of those ex vivo. This method could be used in the future to quantify drug sensitivity in original tumour. This may provide a more predictive model than currently used cell lines.

We have developed a collagen-based in vitro assay which promotes proliferation and invasion from samples of all breast cancer subtypes. Optical Projection Tomography, a three dimensional microscopy technique was utilised to visualise and quantify tumour expansion. This assay may be used to quantify drug response of individual tumour samples.

光学投影トモグラフィを用いたヒト乳癌検体とその分析の長期培養

Breast cancer is a leading cause of mortality in the Western world. It is well established that the spread of breast cancer, first locally and later ...

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue patterning. During animal development, key cell proliferation and patterning events occur very quickly. For instance, in Caenorhabditis elegans all cell divisions required for the larval body plan are completed within six hours after fertilization, with seven mitotic cycles1; the sixteen or more mitoses of Drosophila embryogenesis occur in less than 24 hr2. In contrast, cell divisions during plant development are slow, typically on the order of a day 3,4,5 . This imposes a unique challenge and a need for long-term live imaging for documenting dynamic behaviors of cell division and differentiation events during plant organogenesis. Arabidopsis epidermis is an excellent model system for investigating signaling, cell fate, and development in plants. In the cotyledon, this tissue consists of air- and water-resistant pavement cells interspersed with evenly distributed stomata, valves that open and close to control gas exchange and water loss. Proper spacing of these stomata is critical to their function, and their development follows a sequence of asymmetric division and cell differentiation steps to produce the organized epidermis (Fig. 1).
This protocol allows observation of cells and proteins in the epidermis over several days of development. This time frame enables precise documentation of stem-cell divisions and differentiation of epidermal cells, including stomata and epidermal pavement cells. Fluorescent proteins can be fused to proteins of interest to assess their dynamics during cell division and differentiation processes. This technique allows us to understand the localization of a novel protein, POLAR6, during the proliferation stage of stomatal-lineage cells in the Arabidopsis cotyledon epidermis, where it is expressed in cells preceding asymmetric division events and moves to a characteristic area of the cell cortex shortly before division occurs. Images can be registered and streamlined video easily produced using public domain software to visualize dynamic protein localization and cell types as they change over time.

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

We describe a protocol using chamber slides and media to immobilize plant cotyledons for confocal imaging of the epidermis over several days of development, documenting stomatal differentiation. Fluorophore-tagged proteins can be tracked dynamically by expression and subcellular localization, increasing understanding of their possible roles during cell division and cell-type differentiation.

の長期、高分解能共焦点タイムラプスイメージング<em&gt;シロイヌナズナ子葉</em発芽過程&gt;表皮

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue ...

Multilayer Mounting for Long-term Light Sheet Microscopy of Zebrafish

Light sheet microscopy is the ideal imaging technique to study zebrafish embryonic development. Due to minimal photo-toxicity and bleaching, it is particularly suited for long-term time-lapse imaging over many hours up to several days. However, an appropriate sample mounting strategy is needed that offers both confinement and normal development of the sample. Multilayer mounting, a new embedding technique using low-concentration agarose in optically clear tubes, now overcomes this limitation and unleashes the full potential of light sheet microscopy for real-time developmental biology.

The development of zebrafish can be followed over days with light sheet microscopy when embryos are embedded in optically clear polymer tubes with low-concentration agarose.

多層はゼブラフィッシュの長期シート光顕微鏡用に取り付け

Light sheet microscopy is the ideal imaging technique to study zebrafish embryonic development. Due to minimal photo-toxicity and bleaching, it is ...

LarvaSPA, A Method for Mounting Drosophila Larva for Long-Term Time-Lapse Imaging

Live imaging is a valuable approach for investigating cell biology questions. The Drosophila larva is particularly suited for in vivo live imaging because the larval body wall and most internal organs are transparent. However, continuous live imaging of intact Drosophila larvae for longer than 30 min has been challenging because it is difficult to noninvasively immobilizeimmobilizing larvae for a long time. Here we present a larval mounting method called LarvaSPA that allows for continuous imaging of live Drosophila larvae with high temporal and spatial resolution for longer than 10 hours. This method involves partially attaching larvae to the coverslip using a UV-reactive glue and additionally restraining larval movement using a polydimethylsiloxane (PDMS) block. This method is compatible with larvae at developmental stages from second instar to wandering third instar. We demonstrate applications of this method in studying dynamic processes of Drosophila somatosensory neurons, including dendrite growth and injury-induced dendrite degeneration. This method can also be applied to study many other cellular processes that happen near the larval body wall.

LarvaSPA, A Method for Mounting Drosophila Larva for Long-Term Time-Lapse Imaging

This protocol describes a method for mounting Drosophila larvae to achieve longer than 10 h of uninterrupted time-lapse imaging in intact live animals. This method can be used to image many biological processes close to the larval body wall.

長期経過イメージング用のショウジョウバエ幼虫の取り付け方法

Live imaging is a valuable approach for investigating cell biology questions. The Drosophila larva is particularly suited for in vivo live imaging because ...

Isolation, Transfection, and Long-Term Culture of Adult Mouse and Rat Cardiomyocytes

Ex vivo culture of the adult mammalian cardiomyocytes (CMs) presents the most relevant experimental system for the in vitro study of cardiac biology. Adult mammalian CMs are terminally differentiated cells with minimal proliferative capacity. The post-mitotic state of adult CMs not only restricts cardiomyocyte cell cycle progression but also limits the efficient culture of CMs. Moreover, the long-term culture of adult CMs is necessary for many studies, such as CM proliferation and analysis of gene expression.
The mouse and the rat are the two most preferred laboratory animals to be used for cardiomyocyte isolation. While the long-term culture of rat CMs is possible, adult mouse CMs are susceptible to death and cannot be cultured more than five days under normal conditions. Therefore, there is a critical need to optimize the cell isolation and long-term culture protocol for adult murine CMs. With this modified protocol, it is possible to successfully isolate and culture both adult mouse and rat CMs for more than 20 days. Moreover, the siRNA transfection efficiency of isolated CM is significantly increased compared to previous reports. For adult mouse CM isolation, the Langendorff perfusion method is utilized with an optimal enzyme solution and sufficient time for complete extracellular matrix dissociation. In order to obtain pure ventricular CMs, both atria were dissected and discarded before proceeding with the disassociation and plating. Cells were dispersed on a laminin coated plate, which allowed for efficient and rapid attachment. CMs were allowed to settle for 4-6 h before siRNA transfection. Culture media was refreshed every 24 h for 20 days, and subsequently, CMs were fixed and stained for cardiac-specific markers such as Troponin and markers of cell cycle such as KI67.

Here, we present a protocol for the isolation, transfection, and long-term culture of adult mouse and rat cardiomyocytes.

成人マウスおよびラット心筋細胞の分離、トランスフェクション、長期培養

Ex vivo culture of the adult mammalian cardiomyocytes (CMs) presents the most relevant experimental system for the in vitro study of cardiac biology. ...

Application of Passive Head Motion to Generate Defined Accelerations at the Heads of Rodents

Exercise is widely recognized as effective for various diseases and physical disorders, including those related to brain dysfunction. However, molecular mechanisms behind the beneficial effects of exercise are poorly understood. Many physical workouts, particularly those classified as aerobic exercises such as jogging and walking, produce impulsive forces at the time of foot contact with the ground. Therefore, it was speculated that mechanical impact might be implicated in how exercise contributes to organismal homeostasis. For testing this hypothesis on the brain, a custom-designed ''passive head motion'' (hereafter referred to as PHM) system was developed that can generate vertical accelerations with controlled and defined magnitudes and modes and reproduce mechanical stimulation that might be applied to the heads of rodents during treadmill running at moderate velocities, a typical intervention to test the effects of exercise in animals. By using this system, it was demonstrated that PHM recapitulates the serotonin (5-hydroxytryptamine, hereafter referred to as 5-HT) receptor subtype 2A (5-HT2A) signaling in the prefrontal cortex (PFC) neurons of mice. This work provides detailed protocols for applying PHM and measuring its resultant mechanical accelerations at rodents' heads.

The present protocol describes a custom-designed ''passive head motion'' system, which reproduces mechanical accelerations at rodents' heads generated during their treadmill running at moderate velocities. It allows dissecting mechanical factors/elements from the beneficial effects of physical exercise.

げっ歯類の頭部に定義された加速度を生成するための受動的頭部運動の適用

Exercise is widely recognized as effective for various diseases and physical disorders, including those related to brain dysfunction. However, molecular ...

Collection and Long-Term Maintenance of Leaf-Cutting Ants (Atta) in Laboratory Conditions

Ants are one of the most biodiverse groups of animals on the planet and inhabit different environments. The maintenance of ant colonies in controlled environments enables an enriched comprehension of their biology that can contribute to applied research. This practice is usually employed in population control studies of species that cause economic loss, such as Atta ants. To cultivate their mutualistic fungus, these leaf-cutting ants collect leaves and for this are considered agricultural pests widely distributed throughout the American continent. They are highly socially organized and inhabit elaborated underground nests composed of a variety of chambers. Their maintenance in a controlled environment depends on a daily routine of several procedures and frequent care that are described here. It starts with the collection of queens during the reproductive season (i.e., nuptial flight), which are then individually transferred to plastic containers. Due to the high mortality rate of queens, a second collection can be carried out about 6 months after the nuptial flight, when incipient nests with developed fungus wad are excavated, hand-picked, and placed in plastic containers. In the laboratory, leaves are daily provided to established colonies, and ant-produced waste is weekly removed along with remaining dry plant material. As the fungus garden keeps growing, colonies are transferred to different types of containers according to the experimental purpose. Leaf-cutting ant colonies are placed in interconnected containers, representing the organizational system with functional chambers built by those insects in nature. This setup is ideal to monitor factors such as waste amount, fungus garden health, and the behavior of workers and queen. Facilitated data collection and more detailed observations are considered the greatest advantage of keeping ant colonies in controlled conditions.

Collection and Long-Term Maintenance of Leaf-Cutting Ants Atta in Laboratory Conditions

Here, a protocol is described to successfully collect and maintain healthy Atta (Hymenoptera: Formicidae) ant colonies in laboratory conditions. Additionally, different nest types and configurations are detailed together with possible experimental procedures.

実験室条件における葉切りアリ(atta)の収集と長期維持

Ants are one of the most biodiverse groups of animals on the planet and inhabit different environments. The maintenance of ant colonies in controlled ...

Long-Term Culture of Individual Caenorhabditis elegans on Solid Media for Longitudinal Fluorescence Monitoring and Aversive Interventions

Caenorhabditis elegans are widely used to study aging biology. The standard practice in C. elegans aging studies is to culture groups of worms on solid nematode growth media (NGM), allowing the efficient collection of population-level data for survival and other physiological phenotypes, and periodic sampling of subpopulations for fluorescent biomarker quantification. Limitations to this approach are the inability to (1) follow individual worms over time to develop age trajectories for phenotypes of interest and (2) monitor fluorescent biomarkers directly in the context of the culture environment. Alternative culture approaches use liquid culture or microfluidics to monitor individual animals over time, in some cases including fluorescence quantification, with the tradeoff that the culture environment is contextually distinct from solid NGM. The WorMotel is a previously described microfabricated multi-well device for culturing isolated worms on solid NGM. Each worm is maintained in a well containing solid NGM surrounded by a moat filled with copper sulfate, a contact repellent for C. elegans, allowing longitudinal monitoring of individual animals. We find copper sulfate insufficient to prevent worms from fleeing when subjected to aversive interventions common in aging research, including dietary restriction, pathogenic bacteria, and chemical agents that induce cellular stress. The multi-well devices are also molded from polydimethylsiloxane, which produces high background artifacts in fluorescence imaging. This protocol describes a new approach for culturing isolated roundworms on solid NGM using commercially available polystyrene microtrays, originally designed for human leukocyte antigen (HLA) typing, allowing the measurement of survival, physiological phenotypes, and fluorescence across the lifespan. A palmitic acid barrier prevents worms from fleeing, even in the presence of aversive conditions. Each plate can culture up to 96 animals and easily adapts to a variety of conditions, including dietary restriction, RNAi, and chemical additives, and is compatible with automated systems for collecting lifespan and activity data.

Long-Term Culture of Individual Caenorhabditis elegans on Solid Media for Longitudinal Fluorescence Monitoring and Aversive Interventions

Here, we present a protocol to culture isolated individual nematodes on solid media for lifelong physiological parameter tracking and fluorescence quantification. This culture system includes a palmitic acid barrier around single-worm wells to prevent animals from fleeing, allowing the use of aversive interventions, including pathogenic bacteria and chemical stressors.

縦断的蛍光モニタリングと嫌悪的介入のための固体培地上での個々の カエノラブディティスエレガンスの 長期培養

Caenorhabditis elegans are widely used to study aging biology. The standard practice in C. elegans aging studies is to culture groups of worms on solid ...

Long-Term Culture and Monitoring of Isolated Caenorhabditis elegans on Solid Media in Multi-Well Devices

The nematode Caenorhabditis elegans is among the most common model systems used in aging research owing to its simple and inexpensive culture techniques, rapid reproduction cycle (~3 days), short lifespan (~3 weeks), and numerous available tools for genetic manipulation and molecular analysis. The most common approach for conducting aging studies in C. elegans, including survival analysis, involves culturing populations of tens to hundreds of animals together on solid nematode growth media (NGM) in Petri plates. While this approach gathers data on a population of animals, most protocols do not track individual animals over time. Presented here is an optimized protocol for the long-term culturing of individual animals on microfabricated polydimethylsiloxane (PDMS) devices called WorMotels. Each device allows up to 240 animals to be cultured in small wells containing NGM, with each well isolated by a copper sulfate-containing moat that prevents the animals from fleeing. Building on the original WorMotel description, this paper provides a detailed protocol for molding, preparing, and populating each device, with descriptions of common technical complications and advice for troubleshooting. Within this protocol are techniques for the consistent loading of small-volume NGM, the consistent drying of both the NGM and bacterial food, options for delivering pharmacological interventions, instructions for and practical limitations to reusing PDMS devices, and tips for minimizing desiccation, even in low-humidity environments. This technique allows the longitudinal monitoring of various physiological parameters, including stimulated activity, unstimulated activity, body size, movement geometry, healthspan, and survival, in an environment similar to the standard technique for group culture on solid media in Petri plates. This method is compatible with high-throughput data collection when used in conjunction with automated microscopy and analysis software. Finally, the limitations of this technique are discussed, as well as a comparison of this approach to a recently developed method that uses microtrays to culture isolated nematodes on solid media.

Long-Term Culture and Monitoring of Isolated Caenorhabditis elegans on Solid Media in Multi-Well Devices

Presented here is an optimized protocol for culturing isolated individual nematodes on solid media in microfabricated multi-well devices. This approach allows individual animals to be monitored throughout their lives for a variety of phenotypes related to aging and health, including activity, body size and shape, movement geometry, and survival.

マルチウェルデバイスの固体培地上での単離 されたカエノラブディティスエレガンスの 長期培養とモニタリング

The nematode Caenorhabditis elegans is among the most common model systems used in aging research owing to its simple and inexpensive culture techniques, ...