この研究は、浙江省自然科学財団の助成金(Z23H290001、LY19H280001)の支援を受けました。中国国家自然科学財団の助成金(82274364、81673607、および81774011);湖州科学技術助成金の公共福祉研究プロジェクト(2021GY49、2018GZ24)。浙江省中国医科大学中国医学アカデミー医学研究センターのパブリックプラットフォームからの多大な支援、技術サポート、実験的サポートに感謝します。

1.材料の準備
<ol><li>12 mLのDMEM培地(10%ウシ胎児血清および100 U/mLペニシリン-ストレプトマイシン)で2 x 106 Panc02細胞を培養し、5%二酸化炭素および95%空気の雰囲気下で37°Cおよび95%湿度で48時間維持します。</li>
	<li>Panc02細胞を回収し、28 x g で2分間遠心分離した後、上清を廃棄します。サンプルが適切なサイズ(1 x 107 セル)であることを確認してください、そうしないと、次の固定および脱水手順がうまく機能しません。</li>
	<li>固定液として1 mLの2.5%グルタルアルデヒドを添加し、新鮮なPanc02細胞を1.5 mLマイクロ遠心チューブに4°Cで一晩固定します。 注意: サンプルは、次の各ステップ(ステップ1.3〜1.11)で1,006 x g で5分間遠心分離する必要があります。</li>
	<li>固定液を吸引し、サンプルを0.1 Mリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で2回すすぎ、次に室温で二重蒸留水(ddH2O)でそれぞれ10分間2回すすぎます。</li>
	<li>1%四酸化オスミウム(OsO4)と1.5%フェロシアン化カリウムを含む溶液50 μLを1:1の比率で4°Cで1時間加えます。その後、毎回0.1 M PBSで10分間2回すすぎ、さらにddH2Oですすぎます。</li>
	<li>1 mLの1%チオカルボヒドラジド(TCH)を加え、室温で30分から1時間インキュベートした後、ddH2Oで毎回10分間4回すすぎます。</li>
	<li>50μLの1%OsO4を添加し、室温で1時間固定した後、ddH2Oで毎回10分間4回すすぎます。</li>
	<li>1 mLの2%酢酸ウラニルを4°Cで一晩加え、ddH2Oで4回、毎回10分間すすぎます。</li>
	<li>1 mLのウォルトン溶液(0.066 gの硝酸鉛を10 mLの0.03 mol/Lアスパラギン酸ストック溶液に溶解)を60°Cで加え、さらに1時間インキュベートします。</li>
	<li>ddH2Oで毎回10分間4回すすぎ、次に段階的なアルコールシリーズで毎回10分間脱水します:50%アルコール、70%アルコール、80%アルコール、90%アルコール1x、および100%アルコール2x。その後、100%アセトン中で毎回10分間2回脱水します。脱水には各溶液1 mLを使用します。.</li>
	<li>200 μLのアセトンをPon 812エポキシ樹脂と3:1、1:1、および1:3の比率で混合します。サンプルを室温でそれぞれ2時間、4時間、4時間樹脂に浸し、100%Pon 812エポキシ樹脂を一晩含浸させます。 注:染色および樹脂包埋ステップを実行する場合、これらは有毒物質であるため、ドラフト内で操作することが重要です。さらに、実験中は白衣と耐溶剤手袋を着用する必要があります。</li>
	<li>試料を埋め込み型に入れ、60°Cのオーブンに48時間入れて重合させます。フラット埋め込み29 を使用して、サンプルの周囲の樹脂の外観を減らします。これにより、試料の設置が簡素化され、その後の画像セグメンテーションに対する帯電アーチファクトの影響が軽減されます。 注: 後で水平な切断面を生成するには、金型穴に少量の樹脂を追加し、過剰に充填しないように注意します。</li>
	<li>シリコンウェーハを最初に洗浄し、次に濃縮H 2 SO4 / H 2O2溶液で30分間親水化することによってシリコンウェーハを準備します。ウルトラミクロトームを用いて親水化したシリコンウェーハ上に厚さ70nmのスライスストリップを連続的に回収し、60°Cのオーブンで10分間乾燥させます。 注意: スライスがウェーハの表面に浮かぶときにスライスをゆっくりとキャプチャして、スライスの損失や変形を防ぎます。</li>
</ol>2. 画像取得と3次元再構成
<ol><li>シリコンウェーハをステージに取り付ける前に、切片を蒸留水で3回洗浄し、風乾します。1 cm x 0.5 cmの大きさの導電性カーボンテープをカットし、シリコンウェーハとSEM試料ステージの間に貼り付けてサンプルのセットアップを完了します(図2E)。</li>
	<li>FE-SEM加速電圧パラメータを2 kVに設定し、作動距離は4 mmです(図3B および 表1)。 注意: 信号対雑音比を改善し、画像のノイズを減らすために、可能な限り低倍率で観察してください。倍数が増加すると、SEMのスキャン範囲が狭くなり、画像上の電荷蓄積が増加します。</li>
	<li>上部のメニューバーにある H / Lアイコン をクリックします。まず、低倍率で、ターゲットスライスストリップの最初のセクションの向きを変えてから、 H / L オプション(図3A)をもう一度クリックして高倍率モードに切り替えます。画像の明るさ、コントラスト、および倍率を調整して、目的の構造に適した画像を収集します。</li>
	<li>[プロジェクトビュー]>[データを開く]を選択し、解析する画像ファイルをソフトウェアにインポートします。</li>
	<li>[スライスの整列>編集]をクリックして画像を 整列 し(図4B)、画像の透明度を変更して左下のメニューバーの [強度範囲 ]の値を調整します。ここでは、半自動アライメント戦略を使用します。具体的には、自動位置合わせにより、画像を前の画像と重ね合わせてから、手動で微調整を行います。 注:この作業では、位置合わせのプロセス中に、前の画像を参照として使用し、移動と回転の操作を使用して、2つの画像のターゲット構造を最大限に重ね合わせました。 [現在のスライスペア を整列]をクリックすると、画像を自動的に整列させることができますが、配置が間違っている可能性があります。</li>
	<li>サブボリュームの抽出モジュールを選択し、スタック全体の重なり合う部分のサイズに合わせてアライメントされたデータセットをクリップします。</li>
	<li>セグ メンテーションサブ セクション(図4C)で、 セグメンテーション>リサンプル>保存を選択します。 魔法の杖 のしきい値と ブラシ ツールのサイズを選択して、正しい範囲を選択します。ここでも、最初に 魔法の杖 を使用して適切な広い領域を自動的に選択し、次に ブラシ を使用して詳細を正確に記述することにより、半自動セグメンテーション方法を採用します。 注: マジックワンド は、 マスキング 値を変更し、 描画制限線を使用することにより、対象の構造と周囲の構造の間に存在するピクセル強度の明らかな違いに基づいて画像をセグメント化するために適用できます。画像取得中に発生する帯電アーチファクトを区別することはできません。そのため、ターゲット リージョンのセグメンテーションが正しくなくなる可能性があります。 ブラシ ツールを使用して手動でセグメント化し、生物学的構造を正確に再構築できます。</li>
	<li>[セグメンテーション>選択]で、[+]アイコンをクリックして、選択した領域を追加します(図4C)。</li>
	<li>上記の手順(2.8)を繰り返して、目的の微細構造を再構築するための選択が完了するまで、異なる画像で同じターゲット構造を選択します。 注:ミトコンドリアのリモデリングプロセス中、ターゲットオブジェクトの選択は、連続した画像のグループの中央にある画像から実行する必要があります。最初または最後の画像から必要な領域が選択されている場合、再構築結果は完全な3Dビジュアライゼーションを表示できません。</li>
	<li>地域セグメンテーションが完了したら、オブジェクトのサイズと画像の解像度に最適な結果に従って画像ファイルを生成します。 [切り抜きエディタ]をクリックし、[ 仮想スライダー ]ボックスに番号6を入力します(図4C)。</li>
	<li>左側のドロップダウン メニューで、[ プロジェクト ]サブセクションの下にある灰色の領域を右クリックし、[ サーフェスを生成]>[作成>適用]を選択します。生成されたファイルで、 サーフェス ビュー モジュールを使用して、サーフェス構造と 3D 表現を作成します。</li>
</ol>3. 定量化
<ol><li>[ 小さなスポットを削除]をクリックして適用> (図4D)。 [プロジェクト ]サブセクションで、灰色の領域を右クリックし、[ ラベル解析]>[適用 ]を選択します(図4D)。</li>
	<li>列の名前をカスタマイズし、メジャー グループを選択します。ネイティブ測定ボックスからボリューム3dと長さ3dを選択します。 </li>
	<li>画面の左下隅にある[ 適用 ]ボタンをクリックします。データをコピーし、GraphPadなどの統計ソフトでグラフ化します。</li>
</ol>

膵臓がん細胞のミトコンドリアクリスタを可視化する3D技術

著者は利益相反を宣言しません。

ここで紹介する方法は、連続した超薄膜切片から生成された2D断層画像の積層とセグメンテーションに電子顕微鏡と画像処理技術を適用することを含む3D再構成技術を適用するための有用なステップバイステップガイドです。このプロトコルは、高解像度レベルでの構造の強力な再現性とより高い精度の利点を持つオルガネラ微細構造の3D視覚化によって対処できる2D画像の限界を強調してい?...

ミトコンドリアは細胞内で最も重要な細胞小器官の1つです。それらは細胞の生体エネルギーと代謝の中心的なハブとして機能し1,2、癌において重要な役割を果たします3。膵臓がん(PC)は、その急速な広がりと高い死亡率のために、治療が最も困難ながんの1つです4。主にミトコンドリアの形態の変化によって引き起こされるミトコンドリア機能障害3,5,6,7は、PC8の根底にある疾患メカニズムに関連しています。ミトコンドリアも非常に動的であり、これはネットワーク接続とクリステ構造の頻繁かつ動的な変化に反映されています9。クリステ構造の再形成は、ミトコンドリア機能と細胞状態に直接影響を与える可能性があり10,11、腫瘍細胞の成長、転移、および腫瘍微小環境の変化中に著しく変化します12,13。
近年、科学者たちはEM観察14,15,16,17を用いてこの細胞小器官を研究しています。たとえば、研究者は3D再構成技術を使用してミトコンドリアのダイナミクスを分析しました6、7、18、19。電子顕微鏡画像の3D再構成の一般的な概念と方法は、早くも196820に正式に確立され、電子顕微鏡、電子回折、およびコンピューター画像処理を組み合わせてT4ファージテールを再構築することが含まれていました。これまで、電子顕微鏡3Dイメージング技術は、画像解像度21、自動化度22、処理量23の面で大きな進歩を遂げ、組織レベルからナノメートルスケールのオルガネラ微細構造レベル24まで、生物学研究においてますます幅広い規模で使用されてきました。近年、電子顕微鏡3Dイメージングも幅広い用途の有望な技術となっています25、26、27。
ミトコンドリアクリステへの注目の高まりは、特に微細構造体積イメージングの本質的な要件を示しています。透過型電子顕微鏡(TEM)は、銅グリッド(400メッシュ)28に集められたサンプルを視覚化するために使用され、電子ビームはセクションを通過します。しかしながら、銅グリッドの範囲が限られているため、同じサンプル29の連続スライスを完全に画像化することは不可能である。これは、TEMイメージング中の標的構造の研究を複雑にする。さらに、TEMは、複数のスライスの切断と収集、およびそれらを順次イメージングするなど、時間がかかり、エラーが発生しやすい手動タスクに依存しているため21、大量のサンプルの微細構造再構成には適していません23。現在、TEMカメラアレイ(TEMCA)30 や2台の第2世代TEMCAシステム(TEMCA2)31など、短時間でハイスループットなイメージングを自動化する専用装置を使用することで、大容量サンプルイメージングの高解像度再構成を実現しています。ただし、このタイプのイメージングには、カスタマイズされた機器が必要なため、入手が容易で普遍的であるという利点はありません。
TEMと比較して、SEM32、33に基づいて大面積の数千のシリアル体積画像を自動的に生成する方法は、シリアルイメージングの効率および信頼性を高め、より高いz解像度を提供する34。たとえば、シリアルブロック面走査電子顕微鏡(SBF-SEM)と集束イオンビーム走査電子顕微鏡(FIB-SEM)はどちらも、高速、効率、解像度で微細構造の3D再構成を実現することを可能にしました35,36。ただし、SBF-SEMのダイヤモンドナイフまたはFIB-SEM33,37の集束イオンビームによるフライス加工によって、ブロック表面が機械的に削り取られることは避けられません。試料に対する2つの方法の破壊性のために、さらなる分析のために同じ標的構造を再び再構築することは不可能である38、39、40。さらに、EMを使用して癌細胞の3Dオルガネラ微細構造を再構築し、病理学的変化を観察することを試みた研究はほとんどありません12。このような理由から、膵臓がん細胞などのがん細胞の病態メカニズムをさらに解明するために、ウルトラミクロトームと電界放出型走査電子顕微鏡(FE-SEM)を用いて、ミトコンドリアの微細構造をクリステレベルで解析する新しい断面像を3次元再構成する技術を提案する。この技術により、効率的でアクセスしやすい方法で高解像度のデータを取得できます。ウルトラミクロトームを使用して作られた連続超薄切片は、グリッドケースに半永久的に保管し、数年後でも複数回再イメージングすることができます41。FE-SEMは、高解像度のイメージング、高倍率、汎用性を提供できるため、さまざまな研究分野でツールとして高く評価されています42。オルガネラの微細構造を3Dで表示するために、FE-SEM 43,44によって生成された後方散乱電子を使用して有用な解像度でシリアル2D画像スタックを生成する技術を使用して、特別な装置なしでターゲット領域またはそれらに関連する構造のハイスループットおよびマルチスケールイメージングを達成することもできます45.電荷アーチファクトの生成は、取得した画像の品質に直接影響するため、滞留時間を短くすることが特に重要です。
したがって、本研究では、ミトコンドリアクリステ46の3D構造を再構築するためにこのSEM技術で採用された実験手順について詳しく説明します。具体的には、従来のOTO標本作製法44,47を用いたスライスサンプルの作成、ウルトラミクロトームスライスによる切片採取の完了、FE-SEMによる逐次2Dデータの取得など、Amiraソフトウェアを用いたミトコンドリア領域の半自動セグメンテーションと3D再構成のデジタル化を実現するためのプロセスを紹介します。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>(1S,3R)-RSL3</td>
			<td>MCE</td>
			<td>HY-100218A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>179124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amira</td>
			<td>Visage Imaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspartic acid</td>
			<td>MCE</td>
			<td>HY-42068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified Eagle&#8217;s medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11995115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100983</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferrostatin-1</td>
			<td>MCE</td>
			<td>HY-100579</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10437010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Field emission scanning electron microscope</td>
			<td>HITACHI</td>
			<td>SU8010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A10500.22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead nitrate</td>
			<td>SANTA CRUZ</td>
			<td>sc-211724</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium Tetroxide</td>
			<td>SANTA CRUZ</td>
			<td>sc-206008B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Panc02</td>
			<td>European Collection of Authenticated Cell Cultures&#160;</td>
			<td>98102213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td>BL505A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td>BL302A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pon 812 Epoxy resin</td>
			<td>SPI CHEM</td>
			<td>GS02660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium ferrocyanide</td>
			<td>Macklin</td>
			<td>P816416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiocarbohydrazide</td>
			<td>Merck</td>
			<td>223220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome</td>
			<td>LEICA</td>
			<td>EMUC7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl Acetate</td>
			<td>RHAWN</td>
			<td>R032929</td>
			<td>2020.2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a three-dimensional technique for the visualization of mitochondrial ultrastructural changes in pancreatic cancer cells

未知の情報が豊富であるだけでなく、3次元(3D)の視点から洗練された細胞小器官の微細構造の動的特徴を理解することは、機構研究にとって重要です。電子顕微鏡(EM)は、優れたイメージング深度を提供し、高解像度の画像スタックの再構築を可能にして、ナノメートルスケールでも細胞小器官の微細構造形態を調査できます。したがって、3D再構築は、その比類のない利点のために重要性を増しています。走査型電子顕微鏡(SEM)は、連続したスライスの同じ関心領域から大きな構造を3Dで再構築できるハイスループット画像取得技術を提供します。したがって、細胞小器官の真の3D微細構造を復元するための大規模な3D再構成におけるSEMの適用はますます一般的になっています。このプロトコルでは、膵臓癌細胞のミトコンドリアクリステを研究するために、連続超薄切片と3D再構成技術の組み合わせを提案します。これらの技術がどのように実行されるかの詳細は、オスミウム-チオカルボヒドラジド-オスミウム(OTO)法、シリアル超薄切片イメージング、および視覚化表示を含む、このプロトコルで段階的に説明されています。

Mitochondria are one of the most important organelles in the cell. They serve as the central hub of cellular bioenergetics and metabolism1,2 and play a critical role in cancer3. Pancreatic cancer (PC) is one of the most difficult cancers4 to treat due to its rapid spread and high mortality rate. Mitochondrial dysfunction, which is mainly caused by changes in the mitochondrial morphology3,5,6,7, has been linked to the disease mechanisms underlying PC8. Mitochondria are also highly dynamic, which is reflected by the frequent and dynamic changes in their network connectivity and cristae structure9. The reshaping of the cristae structure can directly impact the mitochondrial function and cellular state10,11, which are significantly altered during tumor cell growth, metastasis, and tumor microenvironment changes12,13.
In recent years, scientists have studied this organelle using EM observation14,15,16,17; for example, researchers have analyzed the mitochondrial dynamics using 3D reconstruction techniques6,7,18,19. The general concept and method for the 3D reconstruction of electron microscopy images were formally established as early as 196820 and involved combining electron microscopy, electron diffraction, and computer image processing to reconstruct the T4 phage tail. Up until now, electron microscopy 3D imaging technology has made significant advancements in terms of the image resolution21, degree of automation22, and processing volume23 and has been used on an increasingly broad scale in biological research, from the tissue level to the organelle ultrastructure level at the nanometer scale24. In recent years, electron microscopy 3D imaging has also become a promising technology for a wide range of applications25,26,27.
The growing attention on mitochondrial cristae particularly illustrates the essential requirements for ultrastructural volume imaging. Transmission electron microscopy (TEM) has been used to visualize samples collected on a copper grid (400 mesh)28, with the electron beam passing through the section. However, due to the limited range of the copper grid, it is impossible to fully image continuous slices of the same sample29. This complicates the study of target structures during TEM imaging. Additionally, TEM relies on time-consuming and error-prone manual tasks, including cutting and collecting multiple slices and imaging them sequentially21, so it is not adapted for ultrastructural reconstructions of large-volume samples23. At present, the high-resolution reconstruction of large-volume sample imaging is achieved through the use of specialized equipment, such as the TEM camera array (TEMCA)30 or two second-generation TEMCA systems (TEMCA2)31, which enable automated high-throughput imaging in a short time. However, this type of imaging does not have the advantage of being easy to obtain and universal due to the requirement for customized equipment.
Compared with TEM, the method for automatically generating thousands of serial volumetric images for large areas based on SEM32,33 enhances the efficiency and reliability of serial imaging and delivers higher z-resolutions34. For example, serial block-face scanning electron microscopy (SBF-SEM) and focused ion beam scanning electron microscopy (FIB-SEM) have both made it possible to achieve the 3D reconstruction of ultrastructure with high speed, efficiency, and resolution35,36. However, it is inevitable that the block surface is mechanically shaved off by the diamond knife of the SBF-SEM or by milling with the focused ion beam of FIB-SEM33,37. Due to the destructiveness of the two methods to the samples, it is not possible to reconstruct the same target structure again for further analysis38,39,40. In addition, few studies have attempted to reconstruct the 3D organelle ultrastructure of cancer cells using EM to observe pathological changes12. For these reasons, in order to further elucidate the pathological mechanisms of cancer cells, such as pancreatic cancer cells, we propose a novel technology for the 3D reconstruction of serial section images using an ultramicrotome and a field emission scanning electron microscope (FE-SEM) to analyze the mitochondrial ultrastructure at the cristae level; with this technology, high-resolution data can be acquired using an efficient and accessible method. The serial ultrathin sections made using an ultramicrotome can be semi-permanently stored in a grid case and reimaged multiple times, even after several years41. FE-SEM is highly valued as a tool in various research fields due to its ability to provide high-resolution imaging, high magnification, and versatility42. In an attempt to display the fine structure of organelles in 3D, the technique for producing serial 2D image stacks with useful resolution using back-scattered electrons produced by FE-SEM43,44 can also be used to achieve high-throughput and multi-scale imaging of target regions or their associated structures without special equipment45. The generation of charge artifacts directly affects the quality of the acquired images, so it is particularly important to keep the dwell time short.
Thus, the present study elaborates on the experimental procedures employed in this SEM technique to reconstruct the 3D structure of mitochondrial cristae46. Specifically, we show the process developed to achieve the semi-automatic segmentation of mitochondrial regions and digitize the 3D reconstruction using Amira software, which also involves making slice samples using the conventional OTO specimen preparation method44,47, completing the section collection using ultramicrotome slicing, and acquiring sequential 2D data by FE-SEM.

著者スポットライト:膵臓がん細胞におけるミトコンドリアの超微細構造変化を視覚化するための3次元技術  

膵臓癌細胞のミトコンドリアの微細構造変化を可視化する3次元技術

This project aims to review the anti-cancer effect of drugs by changing the structure at the subcellular nano-scale level, and establishing the link between organelle morphology and the cancer pathological mechanism. This technology combines traditional electron microscopy technology with three dimensional reconstruction technology without special equipment. Compared to other techniques, it can improve imaging efficiency and the reconstruction flexibility, and the real life reconstruction of target structures at any time.So it's highly easy and universal. This technology of three dimensional reconstruction of the continuous ultra-thin slides can repeatedly restore the real stereochemical without specific expensive equipment. It can be used for qualitative and quantitative analysis of all organelles at any time.It realizes the easy operation of observation.

細胞培養(図1A)では、まず膵臓がん細胞を完全培養液で培養した対照群、(1S,3R)-RSL348(RSL3、フェロトーシス活性化因子、100nM)群、およびRSL3(100nM)プラスフェロスタチン-149(Fer-1、フェロトーシス阻害剤、100nM)群に分けました。以上の実験ステップにより、走査型電子顕微鏡により、対照群、RSL3群、阻害剤群(RSL3+Fer-1群)について、それぞれ3...

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このプロトコルは、ミトコンドリアクリステを再構築して、高精度、高解像度、および高スループットの3Dイメージングを実現する方法について説明します。

Understanding the dynamic features of the cell organelle ultrastructure, which is not only rich in unknown information but also sophisticated from a ...

本研究では、細胞内ナノスケールで構造を変化させ、細胞小器官の形態とがんの病態メカニズムとの関連を確立することで、薬剤の抗がん効果を見直すことを目的とする。この技術は、従来の電子顕微鏡技術と特別な装置なしでの3次元再構成技術を組み合わせたものです。他の技術と比較して、イメージング効率と再構成の柔軟性、およびターゲット構造の実際の再構築をいつでも改善できます。したがって、それは非常に簡単で普遍的です。連続的な超薄型スライドの3次元再構成のこの技術は、特定の高価な装置なしで実際の立体化学を繰り返し復元することができます。いつでもすべての細胞小器官の定性的および定量的分析に使用できます。観察の簡単な操作を実現します。

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Three-Dimensional Technique for the Visualization of Mitochondrial Ultrastructural Changes in Pancreatic Cancer Cells

1.1K ビュー.  School of Pharmaceutical Science of Zhejiang Chinese Medical University. 本研究では、細胞内ナノスケールで構造を変化させ、細胞小器官の形態とがんの病態メカニズムとの関連を確立することで、薬剤の抗がん効果を見直すことを目的とする。この技術は、従来の電子顕微鏡技術と特別な装置なしでの3次元再構成技術を組み合わせたものです。他の技術と比較して、イメージング効率と再構成の柔軟性、およびターゲット構造の実際の再構?...

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Understanding the dynamic features of the cell organelle ultrastructure, which is not only rich in unknown information but also sophisticated from a three-dimensional (3D) perspective, is critical for mechanistic studies. Electron microscopy (EM) offers good imaging depth and allows for the reconstruction of high-resolution image stacks to investigate the ultrastructural morphology of cellular organelles even at the nanometer scale; therefore, 3D reconstruction is gaining importance due to its incomparable advantages. Scanning electron microscopy (SEM) provides a high-throughput image acquisition technology that allows for reconstructing large structures in 3D from the same region of interest in consecutive slices. Therefore, the application of SEM in large-scale 3D reconstruction to restore the true 3D ultrastructure of organelles is becoming increasingly common. In this protocol, we suggest a combination of serial ultrathin section and 3D reconstruction techniques to study mitochondrial cristae in pancreatic cancer cells. The details of how these techniques are performed are described in this protocol in a step-by-step manner, including the osmium-thiocarbohydrazide-osmium (OTO) method, the serial ultrathin section imaging, and the visualization display.

This protocol describes how to reconstruct mitochondrial cristae to achieve 3D imaging with high accuracy, high resolution, and high throughput.

がん研究

Sample Preparation for the Three-Dimensional Reconstruction of Pancreatic Cancer Cell Mitochondria

To begin inoculate 2 million pan02 cells in 12 milliliters of DMEM, and incubate at 37 degrees Celsius and 95%humidity, 5%carbon dioxide, and 35%air. After 48 hours centrifuge the culture at 28 g for 2 minutes and discard the supernatant. Fix the cells by adding 1 milliliter of 2.5%glutaraldehyde in the 1.5 milliliter micro centrifuge tubes overnight at 4 degrees Celsius.The next day centrifuge the samples at 1006 g for five minutes and aspirate the fixative before rinsing the sample twice with 0.1 molar PBS. Subsequently, rinse the samples twice with double distilled water for 10 minutes each. Next, add a 50 microliter solution of 1%osmium tetroxide and 1.5%potassium ferrocyanide at a ratio of 1 to 1 and incubate at 4 degrees Celsius for 1 hour.Centrifuge and rinse the samples twice with 0.1 molar PBS and once with double distilled water. Then add 1 milliliter of 1%thiocarbohydrazide and incubate at room temperature for 30 to 60 minutes. After incubation centrifuge and discard the supernatant before rinsing the samples 4 times with double distilled water.Next, add 50 microliters of 1%osmium tetroxide and allow it to be fixed at room temperature for 1 hour. Centrifuge again and rinse the samples 4 times with double distilled water. Add 1 milliliter of 2%uranyl acetate and allow it to stain at 4 degrees Celsius overnight.After rinsing the samples with double distilled water add 1 milliliter of Walton solution and incubate at 60 degrees Celsius for one hour. After incubation rinse the cells 4 times with double distilled water before dehydration in a graded ethanol series for 10 minutes each. Then dehydrate twice in one milliliter of 100%acetone for 10 minutes each.Next, mix 200 microliters of acetone with Pon 812 epoxy resin at a ratio of 3 to 1, 1 to 1, and 1 to 3. And soak the samples in the resin at room temperature for 2, 4, and 4 hours respectively After respective incubation impregnate the samples overnight in 100%Pon 812 epoxy resin. The next day, transfer the specimens into a flat embedding mold and polymerize them in an oven at 60 degrees Celsius for 48 hours.After polymerization, using an ultra microtome, collect serially sliced strips of 70 nanometers thickness on the hydrolyzed silicon wafers and dry them in a 60 degrees Celsius oven for 10 minutes.

膵臓癌細胞ミトコンドリアの三次元再構成のための試料調製

Image Acquisition and Three-Dimensional Reconstruction of Mitochondrial Cristae

Cut a conductive carbon tape and stick it between the silicon wafers mounted with pancreatic cell sections and SEM specimen stage. Next, set the FESEM accelerating voltage to two kilovolts with a working distance of four millimeters. In the top menu bar, click on the HL icon.Then, at low magnification, orient the first section of the target slice strips, and, again, click on the HL icon to switch to the high magnification mode. Collect an appropriate image for the structure of interest by adjusting the image brightness, contrast, and magnification. Next, select Project View, then Open Data, and import the image files to be analyzed into the software.Align the pictures by clicking on Align Slices and Edit. Then, in the lower left menu bar, adjust the Intensity Range value by modifying the image transparency. Select the Extract Sub-Volume module, and click the aligned data sets to fit the size of the overlapping portion of the whole stack.Next, under the segmentation sub-section, select Resample, then Segmentation, and click Save. Then, choose the threshold of the Magic Wand, and the size of the Brush Tool, to select the correct range. From the Selection menu, click on the Add icon to add the selected area.After completing the regional segmentation, generate an image file following the best results for the size of the object and picture resolution. Click on Crop Editor, and in the Virtual Slider box, enter the number six. Next, from the left dropdown menu, right-click on the gray area under the Project sub-section and select Generate Surface, then Create And Apply.In the generated file, using the Surface View module, create the surface structure and 3D representation. The 2D FESEM images reveal that in the control group, mitochondria were evenly distributed with regular cristae structures. In contrast, the RSL3 group showed shrunk mitochondria with increased membrane density and vague cristae structures.However, not all mitochondrial cristae degenerated in the RSL3 group as some remained intact. Compared to the RSL3 group, the inhibitor group had mostly intact cristae structures with only a few not apparent. The 3D images of the control group provided a more accurate view of the mitochondria and their cristae structures.The RSL3 group 3D images showed irregular and vacuolated mitochondria, while the inhibitor group displayed diverse cristae shapes. The quantification of mitochondrial alterations showed that the RSL3 group had significantly decreased mitochondrial length and volume, compared to the control group, while the inhibitor group showed intermediate results. RSL3 also caused mitochondrial dysfunction and altered cellular metabolism by changing mitochondrial morphology and triggering ferroptosis.