飼育プロトコルの微調整にご協力いただいた過去の B. coprophila ストックキーパー(Jacob E. Bliss、Paula Bonazinga、Anne W. Kerrebrock、Ingrid M. Mercer、Heidi S. Smith)および研究関係者(特にRobert Baird、Michael S. Foulk、Donna Kubai、John M. Urban、Yutaka Yamamoto)に感謝します。 B. coprophila のケアに関する最初の指示は、Helen V. Crouse、Natalia Gabrusewycz-Garcia、Reba M. Goodman、Charles W. Metz、およびEllen Raschによって提供されました。山下由紀子さんとアン・W・ケレブロックさん、 Bradysia (Sciara)ストックセンターを引き受けてくださったことに感謝します。図の作成にご協力いただいたBrian Wiegmann氏(図1)、John M. Urban氏(図4 上段)、Laura Ross氏(図4 下段)、Yutaka Yamamoto氏(図5 左面)、門田Leo氏(図7 、 図8)に心より感謝申し上げます。写真撮影と撮影に協力してくれたAva Filis氏とBrown University Multidisciplinary Laboratoryに感謝します。この原稿にコメントをくださったRobert Bairdに感謝します。 私たちの 研究と維持管理は、NIHとNSFの支援を受けており、最近ではNIH GM121455からS.A.G.への支援を受けています。 B. coprophila の詳細については、現在建設中の Bradysia (Sciara)ストックセンターのウェブサイト(https://sites.brown.edu/sciara/ および https://sciara.wi.mit.edu)をご覧ください。

&lt;i&gt;Bradysia coprophila&lt;/i&gt; Lab Protocols and Chromosomal Research

著者は、宣言する利益相反を持っていません。

ここで紹介した B. coprophila の飼育に関するプロトコルは、この生物を研究室で飼育し、そのユニークな生物学的特徴を探求するための実験を行いたいと考えている科学者にとって有用です。 B. coprophila29 を維持するために寒天ベースに振りかけた酵母とキノコ粉末を使用した給餌方法の最初の説明は、メスの研究室で14種類のSciarid Flys5を飼育するために使用されました。その後、イラクサおよび/またはほうれん草の粉末の添加により、 B. coprophila (Gabrusewycz-Garcia、私信)の活力がさらに増加することが観察されました。これらの方法は、現在培養されている Bradysia impatiens や Lycoriella ingenua など、Sciaridae科の関連種の維持に成功しています(Robert Baird、私信)。
他の方法(以下で説明する代替給餌方法など)は 、B. coprophilaを飼育するために試みられてきましたが、ここで説明するプロトコルは、寒天の表面積あたりの幼虫の最も好ましい比率を持つように最適化されており、最も肥沃な脂肪の成虫を取得し、カビの成長を最小限に抑えています。スケールアップするために、上記のプロトコル2で説明したように、ガラスバイアル中で大量交配を行うことができます。あるいは、数匹(2〜4匹)の成体女性を、 ショウジョウバエ を育てるために使用されるフラスコ(使い捨て6オンス= 177.4 mL角底 ショウジョウバエ ポリプロピレンボトル)に2倍の成人男性と一緒に配置することができます。どちらの場合も、研究者は、フラスコにすべての女性生産者またはすべての男性生産者の母親のみが含まれていることを完全に確信している必要があります。
蛹と成虫は食べないので、幼虫だけに餌を与えます。幼虫が蛹に変わった場合は、バイアルに餌を与えないでください(これの兆候は、最初に出現する成虫のハエが現れるときです)。成虫が閉じたら、バイアルを冷たいインキュベーター(利用可能な場合は16°Cなど)に入れます。週に3回(例:月曜日、水曜日、金曜日)給餌し、幼虫が年をとるにつれてバイアルごとに与えられる食物の量を増やします。たっぷりと餌を与えれば、太った肥沃な大人が報われるでしょう。ただし、餌を与えすぎると白いカビが現れ、それはバイアルに堆積する食物の量を減らすための兆候です。さらに、餌を与えすぎると、寒天の上に厚い食物のパッドが発達し、成虫が出現しにくくなります(鉗子でパッドを取り外すことができますが、パッドで幼虫を外に出さないように注意してください-これをまったく行わなくてもよいのが最善です)。幼虫が少ない(「少数」とマークされている)バイアルは、必要な食物が少なくて済みます。餌が少なすぎると、幼虫は餌を求めてバイアルの壁を登ります。栄養不足の幼虫は、繁殖力の低い小さな成虫をもたらします。
代替給餌方法 幼虫に週に3回ではなく、幼虫の段階で1回だけ餌を与えるために、さまざまな方法が試みられてきました。B.コプロフィラはショウジョウバエスタイルの食品では成長しません。ジョン・アーバン(私信)は、寒天にB.コプロフィラ食品を混ぜようとしましたが、カビが生えすぎました。彼は、2つのカビ防止剤(テゴセプトとプロピオン酸)を組み合わせて別々に追加し、いくつかの異なる濃度を試したところ、カビを抑制するレベルでB.coprophilaに対してすべて毒性があることを発見しました。寒天は、B. coprophilaが酸性pH(プロピアン酸と同様)で病気になるため、pH 6-7(中性)である必要があります。あるいは、週3回の給餌をなくすために、針のないヘラまたは注射器を使用して、交尾後1週間後(つまり、幼虫が出現し始める頃)に、各バイアルの寒天の上に濃厚な酵母ペースト(Red Star活性乾燥酵母を少量の蒸留水と混合して湿らせます)を分注しようとしました。
週3回の給餌を避ける別の方法は、各バイアルに菌類の生きた培養物を追加することです。Bath and Sponsler37 は、Sabouraudの培地を使用した傾斜した寒天表面に、 Chaetoconidia 属(最高)または Baplosporangia 属または Xllescheria属の真菌培養物で縞模様を付ける必要があると報告しました。この菌は 、B. coprophila が導入される数日から1週間前に栽培されました。この後、給餌は必要ありませんでした。この方法の変形は、Ellen Rasch(私信)によっても採用されました。私たちの手では、この方法ではバイアルが濡れすぎており、幼虫は溺れてしまいましたが、生きた真菌のバイアルに対して幼虫の数を最適化するために再度試すことができました。
Arthur Forer(私信)は、ツルバエ38と同じようにB.coprophilaを飼育することに成功しています。このアプローチにより、蛹は湿った張り子で育てられました。その後、成虫を交配させ、卵を新鮮で湿った張り子に置きました。得られた幼虫は、ペトリ皿の張り子に乗せられ、週に2回、イラクサの葉の粉末を与えられました。蛹はケージに入れられ、サイクルが繰り返されました。
山下由紀子さん(私信)は、自然界の鉢植えや湿度の高い温室など、自然界で見られる条件を模倣して、B. coprophilaを土壌で飼育しようと試みましたが、成功しませんでした。しかし、湿度が上がるとカビが問題になることがあります。それにもかかわらず、湿った土壌は、湿った土壌でプラスチックの箱にPseudolycoriella(以前はBradysia)の衛生的な幼虫を育てるために成功裏に使用されてきました。それらは分解されたIlex paraguariensisの葉を与えられ、1.2%酵母抽出物、1.4%コーンスターチ、0.8%オートミール粉、1.2%寒天12を幼虫の後期に補われます。同様に、湿った土壌は、砕いたインゲン豆を湿らせたピートモスに置き換えて、シャリドバエ39,40を育てることができます。
ブラディシアの実験室培養を維持するために、さらに他の方法が採用されてきました:(i)酵母と乾燥血液肥料が添加されたオートクレーブされたジャガイモ41;(ii)乾燥血液45を加えることができる肥料42,43,44;(iii)綿パッドと湿らせたペーパータオル付きのプラスチック容器、挽いた大豆46。
ダニ ダニはショウジョウバエからB.コプロフィラに移すことができます。これを最小限に抑えるには、B. coprophilaをショウジョウバエのストックの近くではなく、別のインキュベーターまたは部屋に保管するのが最善です。さらに、ショウジョウバエを取り扱う前に、その日の早い時間にB.コプロフィラのメンテナンス作業を行ってください。ダニは観葉植物からB.coprophilaに移すこともできるため、植物をB.coprophilaと同じ部屋に保管しないでください。ダニがバイアルに侵入すると、B. coprophilaの体を這う小さな白い球状の生物として見ることができます。ショウジョウバエのダニを破壊する働きをする化学処理は、化学物質がB.コプロフィラを殺すため、B.コプロフィラには使用できません(B.コプロフィラはフェノールなどの有機ガスにも敏感です)。B. coprophila株のダニを駆除する唯一の治療法は、寒天プレート上の胚を手動で収集し、それぞれにダニがいないかどうかを調べ、細い絵筆を使用してそれらを新鮮な寒天バイアルに移すことです。綿入りガーゼプラグと酢酸セルロースフォームフラッグ(ショウジョウバエポリプロピレンバイアルに使用)は、どちらもバイアルへのダニの侵入を防ぐのに役立ちます。
飼育プロトコルの有用性 ここで説明するプロトコルにより、成長を続ける科学者のコミュニティは、 B. coprophila を新旧の新興モデル生物として飼育し、そのユニークな生物学的特徴を研究することができます。新しい研究室グループは、 Bradysia (Sciara)のユニークな生物学的特徴を維持し、調査するために、成長するコミュニティに参加することが奨励されています。

生物学的原理を完全に理解するには、生命の樹にまたがる多くの多様な生物の研究が必要です。19世紀 末までは幅広い生物が記載されていたが、20世紀 半ばまでに実験的研究は一握りのモデル生物に限られるようになった。ゲノム時代の到来と、Tree of Life1の全種のゲノム配列決定が目標となった今、私たちは実験室での実験に用いる生物の種類を拡大し、その多様性を享受する立場にあります。このような実験用モデル生物の新規化には、実験室で維持管理できることが前提となります。ここでは、そのような新興の新旧モデル生物を飼育するためのプロトコルについて説明します。
地球上の動物生活の大部分は、昆虫2の4つの超放射線によって占められています。昆虫の中には、約158,000種の双翅目(真のハエ)3があり、約3000種がSciaridae科(黒カビのブヨ)4です。ショウジョウバエは、双翅目バエの中で最も徹底的に研究されています。下半双翅目バエ(Nematocera)、Bradysia(以前はSciaraと呼ばれていた)coprophilaは、2億年前に「高等双翅目」ハエ(Brachycera)であるショウジョウバエから分岐しました。したがって、B. coprophilaは、D. melanogasterとの比較研究において分類学的に有利な位置にあります(図1)。さらに、B. coprophilaは、それ自体が研究に値する多くのユニークな生物学的特徴を持っています5,6,7。これらの特徴の多くは、生物のすべての細胞が同じDNA含有量を持つというDNA恒常性の法則に反しています。B. coprophilaでは、(i)父方のゲノムは、男性の減数分裂Iの単極性紡錘体で排除されます。(ii)男性の減数分裂IIではXダイアドの非分離があります。(iii)生殖細胞系限定の(L)染色体が体細胞から排除されます。(iv)初期胚では、個人の性別に応じて1つまたは2つのX染色体が排除されます。母方と父方の同族体を区別するための染色体インプリンティングは、B. coprophilaで最初に発見され、これらの染色体除去イベントの多くに作用しています。染色体の除去に加えて、DNA恒常性の別のバイパスは、幼虫の唾液腺ポリテン染色体のDNAパフ遺伝子座での発達的に制御された遺伝子座特異的DNA増幅を介して発生します。これらのユニークな特徴の研究には、B.coprophilaの実験室でのメンテナンスが必要です。その畜産の詳細は、そのような研究を容易にするためにここに提示されています。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66751/66751fig01v3.jpg"> 図1: Bradysia(Sciara)coprophilaの系統発生。 一般的なモデル生物は青のフォントで示され、分類学的順序は赤のフォントで示されています。 Bradysia および他のSciarid菌のブヨ、および蚊は低ジプテランバエ(以前はNematocera亜目)ですが、 ショウジョウバ エ種は高二翅目バエ(亜目:Brachysera)です。図の左側の情報は、Misof et al.33からのものです。右側の情報は、Bertone et al.34 と Wiegmann et al.2 からのものです。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66751/66751fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
以前は、Sciara属は真核生物の中で最も多くの種(700種)を持っていたため、ステファンはそれらを8つ細分化しました。その後、シンは、Sciaridae科をSciarinae亜科(Sciara、Trichosia、Leptosciarellaを含む6属)、Megalosphyinae亜科(Bradysia属を含む)、およびその他の3つのグループ(Pseudolycoriellaを含む)に細分化することを提案しました9。Sciaridaeの系統発生は、近年、いくつかのグループによってさらに研究されています9,10,11。過去数十年にわたって、Sciaridae科の多くの生物の名前が変更されました12。1世紀以上にわたる文献のほとんどは、私たちが研究している生物をSciara coprophilaと呼んでいますが、現在の分類学上の名前はBradysia coprophila(syn. Bradysia tilicolaおよびその他の同義語)10です。それらは世界中で見られ、キノコや他の菌類を食べるため、一般に真菌ブヨとして知られています。それらは、1804年にヨーロッパのMeigen13によって最初に記載され、その後、北アメリカのJohannsen 14,15によって記載されました。コプロフィラ菌はコールドスプリングハーバー研究所で採集され、1900年代初頭にチャールズ・メッツがコロンビア大学の大学院生だったトーマス・ハント・モーガンとともに研究所のストックを確立しました。したがって、現在の株は近親交配の世紀を反映しています。同様に、B. coprophilaの生物学は、Helen Crouse(Barbara McClintockと博士号を取得した)による数十年にわたる細胞遺伝学的研究によってさらに解明されました。
1930年代、Bradysia(Sciara)は、遺伝研究のモデルシステムとしてDrosophila melanogasterと競争しました。その多くのユニークな生物学的特徴にもかかわらず、B. coprophilaは、放射線誘発性の表現型突然変異が遺伝研究に必要であり、B. cophilaがD. melanogasterよりもガンマ線照射に対してわずかに耐性が高いにもかかわらず、後者で達成するのが容易であったため、人気のあるモデル生物としてD. melanogasterに凌駕されました16。ゲノミクスの現代では、これはもはや問題ではありません。近年、B. coprophilaのゲノム配列17,18,19(Urban、Gerbi、Spradling、データは示さず)や形質転換法20,21(Yamamoto and Gerbi、データは示さず)が利用可能になったため、新旧の新興モデルシステムとして活用する機が熟してきたこと、また、この研究に採用する科学者コミュニティが増えていることからも明らかです。この記事では、ラボのメンテナンスの手順について説明します。
B. coprophilaはY染色体を欠いており、子孫の性別は母親によって決定されます。X'(「Xプライム」)染色体を持ち、パラセントリックな反転が長い女性には娘しかいませんが、標準(非反転)X染色体にホモ接合性の女性には息子しかいません5(図2)。X'染色体19の配列情報は入手可能ですが、X'染色体がどのようにして子孫を雌と決定するのかについては、まだ分子メカニズムが解明されていません。男性はX'染色体を持つことはなく、受精後、女性はX'X(X'のヘテロ接合体)またはXXになります。成体のX'X雌は、翅の表現型マーカーによってXX雌と区別できます(図3)。X'Xの女性(娘のみを持つ)は、X'の支配的な波状(W)ウィングマーカーによって認識できます(HoLo2ストックのように)22。あるいは、XXの女性(息子のみを持つ)は、91Sストック23のように、Xの劣性プチ(p)ウィングマーカーで認識できます。この場合、X'Expの女性はフルレングスの(小柄ではない)翼を持ち、娘だけを持ちます。ストック6980は、X染色体上の腫脹(sw)静脈24の劣性マーカーと、X'上の優勢マーカーWavyを運び、クロスの選択のための2つのマーカーを可能にします。Wavyの発現の程度はさまざまで、食品が制限されている過密状態のバイアルや温度が高すぎると弱くなるように見えます。波状の翼の表現型は、幼虫が通常の21°Cではなく冷蔵室(4°-8°C)に保管されている場合、非常に強力です。 劣性プチウィングマーカーは変動せず、非常に簡単に識別できますが、91SストックはHoLo2ストックよりも健康状態が悪いため、使用頻度が低くなります。B. coprophilaの交配スキームをここに示し(図2)、HoLo2、7298、W14株(Supplemental File 1)、91S株(Supplemental File 1)、6980株(Supplemental File 1)、および転座株(Supplemental File 1)について詳細に説明しています。転座ストックはもはや存在しません。これらは、リボソームRNA遺伝子25,26,27を含むXの短腕上のヘテロ染色体(H1、H2、およびH3)の相互転座であった。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66751/66751fig02.jpg"> 図2: B. coprophilaの交配スキーム。 この生物はY染色体を持っていません(男性の体細胞は単一のXを持っています)。母親は自分の子孫の性別を決定します。XXの母親には息子しかおらず、X'Xの女性には娘しかいません。X'染色体は、X染色体と比較すると、長いパラセントリック反転を持っています。この図では、X染色体(またはX ')染色体の父方または母方の系統は、それぞれ青または赤で示されます。精子は常染色体にとって一倍体ですが、減数分裂IIの非分離のためにX染色体の2つのコピーを持っています。初期胚の体細胞系譜は、父方から派生したXの1つまたは2つのコピーを、それぞれ女性または男性である場合に排除します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66751/66751fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66751/66751fig03.jpg"> 図3: B.coprophilaの翼表現型。 成虫の雌のハエは、さまざまな翼の表現型で示されています:(A)まっすぐな翼(XX)、(B)波状の翼(X'WX)、(C)極端な波状の翼(X'WX)冷たいroo mに幼虫を保存した後にしなびた外観を持つ表現型、 (D)痕跡のような小柄な翼(XpXp)、(E)野生型(XX)で腫れていない静脈のないまっすぐな翼、 (F)翼の上端および/または両翼の先端近くに小さな泡(黒い矢印)が現れる静脈が腫れた直線翼(XswXsw)、(G)片方または両方の翼に水ぶくれ(白い矢印)が発生する腫れの極端な例。男性はX'染色体を欠いているため、波状の翼を持つことはありませんが、91S株または6980株ではそれぞれ小柄または腫れた翼があります。スケールバー = 1 mm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66751/66751fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
ストックメンテナンスの目標は、交配の半分が雌の生産母親からの交配であり、半分が雄の生産母親からの交配である交配を行い、次の世代で次の世代の女性と男性の成人の数が等しいようにすることです。ただし、男性のライフサイクルは女性よりも短く、成人男性は成人女性の最大1週間前に出現するため、これには計画も含まれます。自然は、オスの胚が同じ日に交配からメスの幼虫の1〜2日後に幼虫として出現することで、この男女間の非同期性に対応します。しかし、雄と雌の成虫が同時に実験室交配に利用できるようにするために、雌の幼虫の入ったバイアルを室温ではなく室温に置いておくか、雄の幼虫の入ったバイアルをわずかに低い温度(例えば、16°C)に置くことで、雌の発育をいくらか早めることができます。より確実な別のルートは、月曜日に女性生産者の母親と交配を行い、同じ週の金曜日に男性生産者の母親と交配することです。最も簡単なルートは、私たちが採用していることですが、毎週同じ日に女性生産者と男性生産者の母親と交配を行い、連続した週ごとにその日に交配を行うことです。このアプローチでは、1週目の交配から生まれた成体の雌を、2週目の交配から出てきた成体の雄と交配させることができます。
雌 のB. coprophila のライフサイクルは、21°Cで飼育した場合、5週間です(表1)。彼らのライフサイクルの長さは、低温または栄養不足の場合にやや長くなります。オスのB. coprophila のライフサイクルは、メスより0.5-1週間早く蛹になるため、4~4.5週間です。各幼虫のインスターの終わりは、ステロイドホルモンのエクジソンレベルのバーストによって引き起こされるキューティクルの脱落によって特徴付けられます。3つの幼虫の幼虫を持つ D.melanogaster とは異なり、 B.coprophilaは 4つの幼虫の幼虫を持っています。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>発達段階</td>
			<td>交配後日数(dpm)</td>
			<td>ステージの長さ(日数)</td>
		</tr><tr><td>産卵</td>
			<td>1-2</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>胚</td>
			<td>1-2 から 7-8</td>
			<td>~7日間</td>
		</tr><tr><td>幼虫</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>幼虫のインスター1、2、および3</td>
			<td>7-8 から 16-19</td>
			<td>~10</td>
		</tr><tr><td>4番目の幼虫のインスタープレアイスポット</td>
			<td>16-19 から 21-24</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>第4幼虫のインスターアイスポットステージ</td>
			<td>21-24 から 25-28 まで</td>
			<td>4</td>
		</tr><tr><td>蛹</td>
			<td>25-28 から 30-33</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>大人</td>
			<td colspan="2">交配した場合は21°Cで1〜2日生存し、交配しない場合は16°Cで2〜3週間生存します。</td>
		</tr></tbody></table>表1:21°Cでの雌 のB.coprophila のライフサイクル。
B. coprophila は、15°C〜25°Cの範囲のどこにでも保持でき、低温では開発がゆっくりと進行します。この昆虫は湿気の多い環境(観葉植物やキノコの床の土壌に見られる)を好むので、インキュベーター内に脱イオン水を入れたビーカーを保管しています。 B. coprophila は、蓋がゆるくフィットし、ビーカーの水が入った金属製のパン箱に室温で保管できますが、37°C28でヒートショックに陥り、暑い気候では危険です。マイケル・アッシュバーナー氏らは、在庫管理に必要な時間を短縮するために、 D. melanogaster を寒さの中で保存しようと試みましたが、ほとんど成功しませんでした。対照的に、 B. coprophila の主な利点は、中期の幼虫の入ったバイアルを、月に1回だけ給餌するという最小限の手入れで、冷蔵室(4〜8°C)のオープンシェルフに最大3か月間保存できることです。彼らは蛹の段階までの寒さで非常にゆっくりと成長し、バイアルが21°Cに戻されると肥沃な成体として出現します。 おそらく、これは野生での越冬を模倣しています。この寒さによる発育失速は、中期の B. coprophila 幼虫16のガンマ線照射後に見られるものに匹敵するかもしれませんが、正常な発育進行のために戻れないポイントを過ぎた後期幼虫には発生失速は見られません。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar (bacteriological)</td>
			<td>U.S. Biological</td>
			<td>A0930</td>
			<td>https://www.usbio.net;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 FlyStuff Foot Pedal</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>59-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 FlyStuff Blowgun</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>54-104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 FlyStuff UltimaterFlypad</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>59-172</td>
			<td>https://www.geneseesci.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ether fume hood</td>
			<td>Labconco&#160;</td>
			<td>3955220</td>
			<td>Sits on top of lab bench</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160; &#160;</td>
			<td>&#160; &#160;</td>
			<td>&#160; &#160;</td>
			<td>Filter replacement&#160; cat # 6961300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Food: Brewer&#8217;s Yeast Powder</td>
			<td>Solgar</td>
			<td>&#160; &#160;</td>
			<td>Obtain from Amazon or health food store</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160; &#160;</td>
			<td>&#160; &#160;</td>
			<td>&#160; &#160;</td>
			<td>https://www.solgar.com;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Food: Nettle Powder&#160; (pesticide free)</td>
			<td>Starwest Botanicals</td>
			<td>209460-51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Food: Shitake Mushrooms (pesticide free)</td>
			<td>Starwest Botanicals</td>
			<td>202127-5</td>
			<td>https://www.starwest-botanicals.com;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Food: Spinach Powder ( pesticide free)</td>
			<td>Starwest Botanicals</td>
			<td>209583-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Food: Straw (pesticide free )</td>
			<td>Starwest Botanicals</td>
			<td>209465-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jar: clear glass, polypropylene lid</td>
			<td>Fisher Scientific:</td>
			<td>FB02911765</td>
			<td>73 mm dia, 89 mm ht (240 ml) 
			https://www.fishersci.com;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle Probe, wooden handle</td>
			<td>US Geo Supply Inc</td>
			<td>SKU: 4190</td>
			<td>5.75&#8221; long probe, 
			stainless steel needle 
			https://usgeosupply.com; (970)-434-3708</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vials: glass, preferred:</td>
			<td>Wilmad LabGlass</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wilmad-glass custom vials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>28-33 mm inner dia, 33 mm outer dia, 9.5 cm ht 
			Wilmad: https://www.SP-WilmadLabglass.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vials: glass (cheaper and ok)&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-339-26H</td>
			<td>29 mm outer dia, 9.5 cm h 
			&#160;https://www.fishersci.com;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vials: glass (a bit narrow)&#160;</td>
			<td>Genesee Scientific&#160;</td>
			<td>32-201</td>
			<td>24.5 mm outer dia,9.5 cm h 
			thttps://www.geneseesci.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vials: polypropylene&#160;</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>32-114</td>
			<td>28.5 mm outer dia,9.5 cm ht</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vial Plugs</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>roll of non-absorbent cotton</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-456881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cheesecloth</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-055053</td>
			<td>https://www.fishersci.com;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

laboratory maintenance of the lower dipteran fly bradysia (sciara) coprophila: a new/old emerging model organism

下部双翅目バエ、 Bradysia(Sciara)coprophilaの 実験室のストックは、1世紀以上にわたって維持されてきました。 B. coprophila の実験室維持のためのプロトコルは、ここに提示されています。これらのプロトコルは、 B. coprophila を研究する急速に増加する研究室が、(1)男性の減数分裂Iの単極性紡錘体を含む、そのユニークな生物学的特徴を活用するのに役立ちます。(2)男性減数分裂IIにおけるXダイアドの非分離。(3)母方と父方の同族体を区別するための染色体インプリンティング。(4)生殖細胞系限定(L)染色体;(5)染色体の消失(男性の減数分裂Iの父方染色体;初期胚の1〜2本のX染色体;初期胚の体細胞からのL染色体);(6)母親による性別決定(Y染色体はありません)。(7)幼虫の唾液腺ポリテン染色体のDNAパフ遺伝子座での発達的に調節されたDNA増幅。 
近年の B. coprophila ゲノムのシーケンシングとアセンブルの進歩、およびゲノム工学のための形質転換方法論の開発を利用することで、染色体力学のこれらの多くのユニークな特徴を探求することが可能になりました。 研究にB. coprophila を使用する成長中の科学コミュニティは、ハエの交配(息子のみまたは娘のみを持つ母親の表現型マーカー、生化学実験のための大量交配の詳細)、胚のハッチのチェック、幼虫の給餌、およびその飼育に関するその他のコメントについて、ここで説明したプロトコルの恩恵を受けることができます。

A complete understanding of biological principles requires the study of many diverse organisms spanning the Tree of Life. Although a broad range of organisms were described through the end of the 19th century, by the middle of the 20th century experimental studies became restricted to a handful of less than a dozen model organisms. With the advent of the genomic era and the goal to sequence genomes from all species in the Tree of Life1, we are now in a position to expand the types of organisms being used for laboratory experiments and to reap the advantage of their diversity. Such expansion of emerging model organisms for experiments has a prerequisite of being able to maintain them in the laboratory. Here, protocols are described for rearing one such emerging new/old model organism.
The majority of animal life on Earth is accounted for by four super-radiations of Insects2. Within the Insects, there are about 158,000 species of Diptera (true flies)3, with about 3000 species in the family Sciaridae (black fungus gnats)4. The fruitfly Drosophila is the most thoroughly studied of the Dipteran flies. The lower Dipteran fly (Nematocera), Bradysia (previously called Sciara) coprophila, diverged 200 million years ago from Drosophila, which is a &#34;higher Dipteran&#34; fly (Brachycera). Therefore, B. coprophila is in a favorable taxonomic position for comparative studies with D. melanogaster (Figure 1). Moreover, B. coprophila has many unique biological features that are worthy of study in their own right5,6,7. Many of these features disobey the rule of DNA constancy in which all cells of an organism have the same DNA content. In B. coprophila, (i) the paternal genome is eliminated on a monopolar spindle in male meiosis I; (ii) there is non-disjunction of the X dyad in male meiosis II; (iii) germ line-limited (L) chromosomes are eliminated from the soma; and (iv) one or two X chromosomes are eliminated in the early embryo depending on the sex of the individual. Chromosome imprinting to distinguish maternal from paternal homologs was first discovered in B. coprophila and is at play for many of these chromosome elimination events. In addition to chromosome elimination, another bypass of DNA constancy occurs via developmentally regulated, locus-specific DNA amplification at the DNA puff loci in larval salivary gland polytene chromosomes. Studies of these unique features require laboratory maintenance of B.coprophila; details of its husbandry are presented here to facilitate such studies.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66751/66751fig01v3.jpg" /> 
Figure 1: Phylogeny of Bradysia (Sciara) coprophila. Popular model organisms are indicated in blue font and their taxonomic order in red font. Bradysia and other Sciarid fungus gnats as well as mosquitoes are lower dipteran flies (formerly, suborder Nematocera), whereas Drosophila species are higher dipteran flies (suborder: Brachysera). Information on the left side of the figure is from Misof et al.33; information on the right side is from Bertone et al.34 and Wiegmann et al.2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66751/66751fig01large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
Previously, the genus Sciara had the largest number (700) of species for any eukaryote, prompting Steffan to subdivide them8. Subsequently, Shin proposed that the Sciaridae family be subdivided into the subfamily Sciarinae (with six genera including Sciara, Trichosia, and Leptosciarella), the subfamiliy Megalosphyinae (including the genus Bradysia) and three other groups (including Pseudolycoriella)9. The phylogeny of the Sciaridae has been studied further by several groups in recent years9,10,11. Over the past several decades, the names of many organisms in the Sciaridae family have changed12. Although most of the literature spanning more than a century refers to the organism that we study as Sciara coprophila, its current taxonomic name is now Bradysia coprophila (syn. Bradysia tilicola and other synonyms)10. They are found worldwide and are commonly known as fungus gnats since they eat mushrooms and other fungi. They were first described in 1804 by Meigen13 in Europe and subsequently by Johannsen14,15 in North America. B. coprophila was collected at Cold Spring Harbor Laboratory and laboratory stocks were established by Charles Metz in the early 1900s when he was a graduate student at Columbia University with Thomas Hunt Morgan. Thus, the current stocks reflect a century of inbreeding. Similarly, the biology of B. coprophila was further elucidated by decades of cytogenetic studies by Helen Crouse (who did her Ph.D. work with Barbara McClintock).
In the 1930s, Bradysia (Sciara) competed with Drosophila melanogaster as a model system for genetic studies. Despite its many unique biological features, B. coprophila was eclipsed by D. melanogaster as a popular model organism since radiation-induced phenotypic mutations were needed for genetic studies and were easier to achieve in the latter, even though B. coprophila is only slightly more resistant to gamma irradiation than D. melanogaster16. In the modern era of genomics, this is no longer a concern. Since the genome sequence17,18,19 (Urban, Gerbi, and Spradling, data not shown) and methods for transformation20,21 (Yamamoto and Gerbi, data not shown) for B. coprophila have recently become available, the time is now ripe to utilize it as a new/old emerging model system, as seen by the growing community of scientists that have adopted it for their research. This article describes procedures for its laboratory maintenance.
B. coprophila lacks a Y chromosome, and the sex of the offspring is determined by the mother. Females that have the X&#39; (&#34;X-prime&#34;) chromosome with a long paracentric inversion will have only daughters, whereas females that are homozygous for the standard (non-inverted) X chromosome will have only sons5 (Figure 2). Sequence information is available for the X&#39; chromosome19, but the molecular mechanism remains to be elucidated on how the X&#39; chromosome determines that offspring will be females. Males never have the X&#39; chromosome, and after fertilization, females are X&#39;X (heterozygous for the X&#39;) or XX. Adult X&#39;X females can be distinguished from XX females by phenotypic markers on the wing (Figure 3). X&#39;X females (who will have only daughters) can be recognized by the dominant Wavy (W) wing marker on the X&#39; (as in the HoLo2 stock)22. Alternatively, XX females (who will have only sons) can be recognized by the recessive petite (p) wing marker on the X as in the 91S stock23. In this case, X&#39;Xp females will have full-length (not petite) wings and will have only daughters. The stock 6980 carries a recessive marker on the X chromosome for swollen (sw) veins24, as well as the dominant marker Wavy on the X&#39;, allowing two markers for selection for crosses. The degree of expression of Wavy can vary and seems weaker in overcrowded vials where food is limiting or if the temperature becomes too warm. The Wavy wing phenotype is exceptionally strong if larvae are kept in the cold room (4&#176;-8 &#176;C) instead of the usual 21 &#176;C. Although the recessive petite wing marker is not variable and is very easy to identify, 91S stocks are used less frequently since they are less healthy than the HoLo2 stock. The B. coprophila mating schemes are presented here (Figure 2), and described in detail for the HoLo2, 7298, and W14 stocks (Supplemental File 1), the 91S stock (Supplemental File 1), the 6980 stock (Supplemental File 1), and the translocation stocks (Supplemental File 1). The translocation stocks are no longer extant; they were reciprocal translocations of heterochromomeres (H1, H2, and H3) on the short arm of the X that contains the ribosomal RNA genes25,26,27.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66751/66751fig02.jpg" /> 
Figure 2: Mating scheme for B. coprophila. This organism has no Y chromosome (the male soma has a single X); mothers determine the sex of their offspring. XX mothers have only sons and X&#39;X females have only daughters. The X&#39; chromosome has a long paracentric inversion when compared to the X chromosome. The paternal or maternal lineage of the X (or X&#39;) chromosome is denoted by blue or red, respectively, in this figure. Sperm are haploid for the autosomes but have two copies of the X chromosome due to non-disjunction in meiosis II. The somatic lineage of early embryos eliminates one or two copies of the paternally derived X if they will be female or male, respectively. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66751/66751fig02large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66751/66751fig03.jpg" /> 
Figure 3: Wing phenotypes of B. coprophila. Adult female flies are shown with various wing phenotypes: (A) straight-wing (XX), (B) Wavy wing (X&#39;WX), (C) extreme Wavy wing (X&#39;WX) phenotype that has a shriveled appearance after storing larvae in the cold room, (D) petite wing (XpXp) that is vestigial-like, (E) straight wing with wildtype (XX) and not swollen veins, (F) straight wing with swollen veins (XswXsw) where small bubbles (black arrows) appear on the upper edge of the wing and/or near the tip of both wings, (G) extreme example of swollen where a blister (white arrow) occurs on one or both wings. Males lack the X&#39; chromosome and therefore will never have Wavy wings, but they have petite or swollen wings in the 91S stock or 6980 stock, respectively. Scale bar = 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66751/66751fig03large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
The goal in stock maintenance is to perform crosses where half the crosses are from female-producing mothers and half the crosses from male-producing mothers to have equal numbers of female and male adults in the next generation for subsequent crosses. However, this also involves planning since the life cycle for males is shorter than for females and adult males emerge up to a week before adult females. Nature accommodates for this asynchrony between the sexes by having the male embryos emerge as larvae 1-2 days after the female larvae from a cross on the same date. However, to ensure that male and female adults are available at the same time for laboratory crosses, female development can be somewhat speeded up by leaving vials with female larvae at room temperature rather than at 21 &#176;C or placing vials with male larvae at slightly cooler temperatures (e.g., 16 &#176;C). Another route that is more foolproof is to do crosses with female-producer mothers on Monday and crosses with male-producer mothers on Friday of the same week. The easiest route, which is what we employ, is to perform crosses with female-producer and male-producer mothers on the same day each week and perform crosses on that day in each consecutive week. In that approach, adult females from a cross on week 1 can be mated with adult males that emerged from a cross on week 2.
The life cycle for female B. coprophila is 5 weeks when raised at 21 &#176;C (Table 1). The length of their life cycle is somewhat longer at cooler temperatures or if they are underfed. The life cycle of male B. coprophila is ~4-4.5 weeks since they pupate 0.5-1 week before females. The end of each larval instar is marked by the shedding of the cuticle, which is triggered by a burst in the level of the steroid hormone ecdysone. Unlike D. melanogaster, which has three larval instars, B. coprophila has four larval instars.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Developmental Stage</td>
			<td>Days post mating (dpm)</td>
			<td>Length of stage (days)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg laid</td>
			<td>1-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryo</td>
			<td>1-2 to 7-8</td>
			<td>~7 days</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Larva&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Larval instars 1, 2, and 3</td>
			<td>7-8 to 16-19</td>
			<td>~10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4th larval instar pre-eyespot</td>
			<td>16-19 to 21-24</td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4th larval instar eye-spot stage</td>
			<td>21-24 to 25-28</td>
			<td>4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pupa&#160;</td>
			<td>25-28 to 30-33</td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adult</td>
			<td colspan="2">lives 1-2 days at 21 &#176;C if mated or lives 2-3 weeks at 16 &#176;C if not mated.&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Table 1: Life cycle of female B. coprophila at 21 &#176;C.
B. coprophila can be kept anywhere in the range of 15 &#176;C-25 &#176;C, with development progressing more slowly at cooler temperatures. This insect prefers a humid environment (being found in the soil of houseplants or mushroom beds), so we keep a beaker with deionized water in the incubator. B. coprophila can be kept at room temperature in a metal bread box with a loosely fitting lid and containing a beaker of water, but they go into heat shock at 37 &#176;C28, which is a danger in hot climates. Michael Ashburner and others have tried with little success to store D. melanogaster in the cold to reduce the time needed for stockkeeping. In contrast, a major advantage of B. coprophila is that vials with mid-stage larvae can be stored for up to 3 months on an open shelf in the cold room (4-8 &#176;C) with minimal care of only feeding once a month. They develop extremely slowly in the cold up to the pupal stage and will emerge as fertile adults when the vials are brought back to 21 &#176;C. Presumably, this mimics their overwintering in the wild. This cold-induced developmental stalling might be comparable to that seen after gamma irradiation of mid-stage B. coprophila larvae16, but developmental stalling is not seen in late-stage larvae that have passed the point of no return for their normal developmental progression.

Author Spotlight: Exploring &lt;i&gt;Bradysia coprophila&#039;s&lt;/i&gt; Unique Biology &amp;#8211; A Guide to Laboratory Maintenance

下部双翅目バエ Bradysia(Sciara)coprophilaの実験室維持:新/古い新興モデル生物

ここで説明するプロトコルは、 B. coprophilaの飼育に成功したことが証明されています。最近閉鎖された脂肪の成体が交配のために選択されると(図4)、交配の90%以上が受精可能であり、子孫を産むことができます。出生率の成功は、株によって異なります(表2)。ストック7298(ウェーブマーカー付きX'染色体)は、最も健康な株であったが、明らかにゲノム再配列32を生成するDNA可動要素の活性化により、衰退期を経験した。HoLo2株は、7298に由来する健康な株であり、ゲノムの再配列が明らかに安定しており、株センターの親株である7298株に取って代わったようです。HoLo2株は、 B. coprophila のゲノム配列決定に使用されたもので、さまざまな研究室グループで最も広く使用されているものです。最近、HoLo2ハエのCRISPR突然変異導入を使用して、蛍光眼マーカー(山本とGerbi、データは示さず)による形質転換に使用される白眼表現型を持つW14ストックが作成されました。W14株は非常に堅牢です。6980ストック(波状の翼と腫れた静脈マーカー)はやや堅牢性が低く、91Sストック(プチウィングマーカー)はさらに堅牢性が劣ります。
交配が成功すると、胚が得られます(図5)。胚は、7番目 から9番目の 切断分裂で捺印された父方のX染色体の除去を受けます。さらに、生殖細胞系限定のL染色体は、5番目 から6番目の 切断分裂で胚の体細胞系譜から排除されます。胚は幼虫として出現しますが、これも存在する可能性のあるカビと混同しないでください(図6)。眼点(成虫の目への分布)は、4番目の 幼虫の幼虫の後半に現れます(図7)。眼点のサイズは、DNAパフ増幅の開始と進行のための便利な表現型マーカーを提供し、これは自然に発生する発生制御部位特異的な染色体内DNA(遺伝子)増幅の2つの既知の例の1つです。その後、蛹が発達し、目を満たす色素の量が精子形成における減数分裂IおよびIIの発達マーカーとして機能する可能性があります(図8)。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66751/66751fig04.jpg"> 図4:成虫 のB. coprophila ハエの交配。 上段は、HoLo2株の3種類の成虫フライ、波状の翼を持つ雌産みの母体(X'WX成体メス)、まっすぐな翼を持つ雄産の母親(XX匹の成体メス)、直線翼のオス(X0匹の成オス)を示しています。雌のハエの後端にある尖った産卵管と、オスのハエの後端にあるフック型のクラスパーに注意してください。下のパネルは、オスとメスの交尾を示しており、オスのクラスパーがメスの産卵管をつかんでいます。精子は女性の精子に蓄えられ、卵子が外部に排出されるときに受精します。成体の長さは2.0mm(オス)、2.5mm(メス)です。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66751/66751fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66751/66751fig05v2.jpg"> 図5: B.coprophila の胚。 左上のパネルは、解剖顕微鏡で標準光を使用した胚の図です。合胞体細胞質の核は黒い点として現れます。右側のパネルは、蛍光顕微鏡を使用して、胚のヨウ化プロピジウム染色された核を視覚化しています。胚の平均長さは200ミクロン、平均幅は150ミクロンです。生殖細胞の核は、サイクル6(胚が前方に傾いた状態)と7-9サイクルで見られるように、胚の後極に集まり、その後、体細胞核が散在します。体細胞系譜におけるL染色体の排除は、切断分裂5または6で発生します。体細胞系譜におけるX染色体の排除は、7番目、8番目、または9番目の 切断分裂で発生します。細胞化は、サイクル11の期間に起こります。左の表は、22°Cでの各分周サイクルの平均時間を示しています。 左側のテーブルと右側のパネルは、de Saint Phalle and Sullivan35の許可を得てアレンジしたものです。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66751/66751fig05large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66751/66751fig06.jpg"> 図6: B. coprophila の胚が幼虫として出現する。 産卵後に死亡した成体女性の産卵管の近くに胚の塊(青い太い矢印)が見られます。産卵から1週間後、胚は若い幼虫になり、そのうちのいくつかは黒い矢印で示されています。新しく出現した幼虫は、前端に黒い顎と半透明の体を持っています。それらは寒天表面の上を移動し、動かないカビと混同しないでください。挿入図には、白いフィラメント(赤い矢印)と先端に黒い胞子(緑の矢印)があり、新しく出現した幼虫よりもわずかに小さいカビが見られます。スケールバー = 1 mm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66751/66751fig06large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66751/66751fig07.jpg"> 図7: B. coprophila 幼虫の眼点ステージ。 眼点は、幼虫の前方、顎のすぐ後ろに形成され、数が増える色素顆粒で構成されています。アイスポットは、大人の目へのanlageです。上のパネルは、解剖顕微鏡で視覚化された幼虫を示しています。下のパネルは、位相差顕微鏡を使用して眼点を拡大した図で、蒸留水の滴とカバーガラスが上に軽く浮かんでいる顕微鏡スライド上の幼虫を視覚化します。アイスポットステージの命名法は、Gabrusewycz-Garcia30 によるもので、顆粒の数は最長の列(例えば、12)でカウントされ、最も長い列を除いた追加の列の数が記される(例えば、アイスポットステージ12x6の場合は6)。唾液腺ポリテン染色体における部位特異的DNA増幅の開始は、アイスポットステージ10x5で始まり、遺伝子座での転写のバーストおよびDNAパフ31の拡張がある14x7で完了する。その後のエッジアイ/ドロップジョーの段階で、アイスポット顆粒は融合し始め、正中線から横方向に移動します。幼虫の体長が短くなります。さらに、DNAパフはこの段階で凝縮します。21°Cで各眼点ステージを横切るのに約1日かかります。スケールバー = 1 mm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66751/66751fig07large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66751/66751fig08.jpg"> 図8: B. coprophila の蛹の発達。 蛹化中、神経系を除くすべての幼虫組織は組織化し、想像椎間板の細胞分裂によって生じる成体組織に置き換えられます。ボディカラーはホワイトからタン、ブラウン、ブラックへと変化します。色素は徐々に蛹の目を埋めます。減数分裂IおよびIIは、色素36で満たされた目の1/4から1/2を持つ雄の蛹に発生します。スケールバー = 1 mm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66751/66751fig08large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>在庫名</td>
			<td>マーカー</td>
			<td>出生率</td>
			<td>コメント</td>
		</tr><tr><td>7298</td>
			<td>波状(W)ウィング</td>
			<td>~75%</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>ホロ2</td>
			<td>波状(W)ウィング</td>
			<td>~90%</td>
			<td>7298から派生</td>
		</tr><tr><td>W14</td>
			<td>波状(W)ウィング。白目</td>
			<td>~95%</td>
			<td>HoLo2から派生</td>
		</tr><tr><td>6980</td>
			<td>波状(W)ウィング。腫れた(SW)静脈</td>
			<td>~65%</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>91Sの</td>
			<td>弱い波状(W)ウィング。プチ(P)ウィング</td>
			<td>~50%</td>
			<td>ウェイビーマーカーは91Sを救うために十字架で導入されました</td>
		</tr></tbody></table>表2:Bradysia(Sciara)coprophilaのストック。Gerbi6 の表 1 に、これらのマーカーと、現存しなくなった他のマーカーの一覧を示します。X27のセントロメア端での5つの転座(T1、T23、T29、T32、T70)は、Gerbi6の図8にまとめられていますが、現存していません。
補足ファイル1:HoLo2(および7298とW14)の交差、91Sの交差と救助、6980の交差、転座の交差。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66751/Supplemental%20Materials.zip" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

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この論文では、下部双翅目バエ Bradysia(Sciara)coprophilaの実験室のメンテナンス(交配と摂食を含む)について概説します。

Laboratory stocks of the lower dipteran fly, Bradysia (Sciara) coprophila, have been maintained for over a century. Protocols for laboratory upkeep of B. ...

私たちは、減数分裂、染色体インプリンティング、生殖細胞特異的染色体、染色体排除、母体の性決定、および汚染染色体DNAパフにおけるDNA増幅における単極性紡錘体およびx-dyad非分離を含むそのユニークな生物学的特性のいくつかを研究するために、下部双翅目フライ、Bradysia、別名Sciara coprophilaを維持します。当研究室では、山本豊がBradysia coprophilaのゲノム形質転換の方法論を開発しました。さらに、この生物のトランスクリプトームが利用可能になり、そのゲノムはジョン・アーバンによって配列決定され、組み立てられました。これらのブレークスルーにより、Bradysia coprophilaのユニークな生物学の探求が可能になります。成長を続ける科学者のコミュニティに参加して、Bradysia coprophilaのユニークな特性に取り組むことをお勧めします。あなたの成果は、細胞生物学や発生生物学にとって根本的に重要な分子メカニズムを解明するでしょう。ここで紹介する飼育プロトコルは、ご自身の研究室でBradysia coprophilaを維持するためのチュートリアルとして機能します。

laboratory-maintenance-lower-dipteran-fly-bradysia-sciara-coprophila

Research

JoVE Journal

Biology

Laboratory Maintenance of the Lower Dipteran Fly Bradysia (Sciara) coprophila: A New/Old Emerging Model Organism

577 ビュー.  Brown University. 私たちは、減数分裂、染色体インプリンティング、生殖細胞特異的染色体、染色体排除、母体の性決定、および汚染染色体DNAパフにおけるDNA増幅における単極性紡錘体およびx-dyad非分離を含むそのユニークな生物学的特性のいくつかを研究するために、下部双翅目フライ、Bradysia、別名Sciara coprophilaを維持します。当研究室では、山本豊がBradysia coprophilaのゲノム形質転換...

ビデオ: Author Spotlight: Exploring Bradysia coprophila's Unique Biology &#8211; A Guide to Laboratory Maintenance

Laboratory stocks of the lower dipteran fly, Bradysia (Sciara) coprophila, have been maintained for over a century. Protocols for laboratory upkeep of B. coprophila are presented here. These protocols will be useful for the rapidly increasing number of laboratories studying B. coprophila to take advantage of its unique biological features, which include (1) a monopolar spindle in male meiosis I; (2) non-disjunction of the X dyad in male meiosis II; (3) chromosome imprinting to distinguish maternal from paternal homologs; (4) germ line-limited (L) chromosomes; (5) chromosome elimination (paternal chromosomes in male meiosis I; one to two X chromosomes in early embryos; L chromosomes from the soma in early embryos); (6) sex determination by the mother (there is no Y chromosome); and (7) developmentally regulated DNA amplification at the DNA puff loci in larval salivary gland polytene chromosomes. 
It is now possible to explore these many unique features of chromosome mechanics by using the recent advances in sequencing and assembly of the B. coprophila genome and the development of transformation methodology for genomic engineering. The growing scientific community that uses B. coprophila for research will benefit from the protocols described here for mating the flies (phenotypic markers for mothers that will have only sons or only daughters; details of mass mating for biochemical experiments), checking embryo hatch, feeding larvae, and other comments on its rearing.

This paper outlines the laboratory maintenance (including mating and feeding) of the lower dipteran fly Bradysia (Sciara) coprophila.

生物学

Maintenance and Rearing of Bradysia (Sciara) coprophila Larvae in a Laboratory Setup

To set up the mating crosses, place the Bradysia coprophila adult male flies on a white fly pad. Use fine tipped forceps to gently pick up the fattest adult by its middle or hind leg. Then place the anesthetized adult female flies on a white fly pad.Using fine tipped forceps, pick up an adult female by its hind leg. One day after mating, push the wings of the anesthetized adult females into 2.2%agar in a Petri plate. Once all the female flies are impaled on the agar, gently squeeze the thorax with forceps.The female will lay a cluster of fertilized eggs within 30 to 60 minutes. Use a dissecting microscope to score the newly emerged larvae. Observe the inch worm-like motion of the newly emerged larvae as they crawl on the surface of the 2.2%agar.After removing the vial plug, examine the vial for the age and number of larvae. Pick up some straw between the second and third fingers or between the thumb and second fingers, and rotate the fingers against each other to deposit the appropriate amount of straw into the vial. On the same day that the larvae emerged, or up to two days later, sprinkle in a tiny bit of food that has been poured into a small bowl for easier access, and replace the gauze plug.For one week old larvae, add more food to just cover the surface of the agar and replace the gauze plug. For the two week old larvae, sprinkle in a generous amount of food to cover the agar surface and replace the gauze plug. Once the larvae attain the late fourth instar stage and begin to pupate, add a generous amount of food on the agar surface.Stop feeding once adults begin to emerge. Do not feed vials with adult flies and do not remove the gauze plug. If there is white mold in the vial, use 70%ethanol on a laboratory wipe to clean a long metal probe.Insert the clean probe into the vial to tap down the mold on the surface of the agar. Then clean the probe with a laboratory wipe dampened with 70%ethanol before storing or using it on another vial. Add only a small amount of food without disturbing the top of the agar, and replace the plug.