炭素含有粒子状物質に曝露された気道マクロファージの炭素含有量の測定

私たちの研究の範囲には、炭素含有粒子状物質への曝露のバイオマーカーとして、気道マクロファージの炭素含有量を測定する非侵襲的な方法の開発と検証が含まれます。私たちは、この大規模な個別曝露評価の方法の精度と信頼性を決定することを目指しています。私たちのプロトコルは、気道マクロファージの炭素含有量を測定するための非侵襲的で正確な標準化された方法を提供します。

内部曝露バイオマーカーとして、これは炭素含有粒子状物質への効果的かつ正確な個々の曝露です。当社のプロトコルは、炭素含有粒子状物質への個々の曝露に対する直接的で信頼性の高いバイオマーカーを提供します。この手法は、誘導された喀痰を用いた大規模な定量化が可能となり、他の手法と比較して精度と信頼性の両方が向上します。

まず、2ミリリットルの喀痰サンプルを遠心分離チューブに集めます。次に、調製した固定液20〜30ミリリットルをチューブに加え、内容物を十分に混合します。細胞懸濁液用の消化液を調製するには、必要な投与量に応じて、0.1グラムのジチオスレイトールを100ミリリットルの生理食塩水に溶解します。

次に、喀痰を含むチューブを1, 998 Gで摂氏4度で30分間遠心分離します。次に、上清を捨てます。沈殿物に等量の喀痰消化物を加えます。

渦巻き、混合物をよく振とうします。その後、チューブを摂氏37度のウォーターバスに完全に液化するまで置きます。次に、70マイクロメートルのフィルターメンブレンを使用して液化混合物をろ過します。

ろ過した溶液を500Gで摂氏4度で7分間遠心分離します。細胞を沈殿させたまま、上清を捨てます。次に、細胞沈殿物をデュシェンヌ型リン酸緩衝液に再懸濁します。

溶液を500 Gで摂氏4度で7分間遠心分離し、純粋な細胞沈殿物を得ます。細胞塗抹標本の調製には、200〜600マイクロリットルのリン酸緩衝液を細胞沈殿物に加え、十分に混合します。次に、20マイクロリットルの細胞懸濁液を採取し、細胞塗抹標本を作成します。

乾燥した塗抹標本を市販の染色液で10秒間固定します。その後、塗抹標本を染色液Aに8秒間浸します。染色中は、スライドをゆっくりと上下に持ち上げてから、流水で余分な汚れを洗い流してください。

細胞内には、はっきりと見える黒色炭素粒子の小さな凝集体が観察され、炭素粒子の量はさまざまでした。まず、顕微鏡で汚れた喀痰スライドを画像化します。よく染色され、形態学的に無傷のマクロファージをランダムに選択し、その画像をキャプチャします。

ImageJソフトウェアを使用して、正確なピクセル変換のためのスケールを測定します。「メジャー」を選択し、「スケールの設定」をクリックします。[距離] をピクセル単位で入力し、実際の長さと [長さの単位] マイクロメートルを入力します。

次に、グローバルオプションにチェックマークを付けます。次に、セルの輪郭を不規則な形状で作成し、フリーハンド選択を使用して背景を削除します。[編集]で、[外部をクリア]を選択します。

[分析] と [測定] を使用して、セルの合計面積を測定します。EditとCutで核を切り取ります。グレースケール画像を白黒に変換します。

[画像]、[タイプ]、および [8 ビット] をクリックします。細胞染色に基づいてグレースケール値を調整し、炭素粒子を正確にカウントするには、[Image] (画像) に移動し、[Adjust] (調整)、[Threshold] (しきい値)、および [Apply] (適用) を選択します。最後に、「分析」をクリックし、「測定」を選択します。

カーボンブラックの包装作業者は、対照群よりも気道マクロファージの炭素含有量が高かった。