ATPレベルや酸素消費率などの分野の機能にも重要な質問に答えるメッサーです。新しいまたは1ページ古い、この技術は、それが実行しやすいことであり、それは細胞ミトコンドリア機能の特別な評価のために多くです。この実験を開始するために、ガラス底ペトリ皿に20,000個のHepG2細胞をシードする。
インキュベーターにβ-ヘキサクロルシクロヘキサンまたはB-HCHを摂氏37度、CO2を5%24時間加えます。DMEM細胞培地に無水DMSOを添加してミトコンドリアグリーン蛍光プローブ溶液を1ミリモル調製した。その後、ガラス底ペトリ皿の細胞にこの溶液の皿当たり1ミリリットルを追加します。
そして、摂氏37度で45分間インキュベートします。インキュベーション後、ミトコンドリア緑色蛍光プローブ溶液を細胞から取り出します。37°C DMEM細胞培養培地で作りたての1皿につき1ミリリットルを加えます。
ミトコンドリアで緑色蛍光を検出するには、共焦点顕微鏡で細胞を観察します。細胞ATPのレベルを評価するために、6つのウェルプレートに20,000 HepG2細胞に播種する。β-HCHを加え、摂氏37度で24時間インキュベートします。
各ウェルの細胞に200マイクロリットルのライシスバッファーを加えます。摂氏4度で5分間Gの12,000倍で遠心分離機を、テキストプロトコルに記載されているように上清の収集を進める。プレートに100マイクロリットルのATP検出バッファーを追加します。
収集した細胞上清の100マイクロリットルを室温で96ウェルプレートに加え、テキストプロトコルに記載されているようにルミノメーターで細胞ATPを検出する。ミトコンドリア膜電位の評価のために、前に述べたようにβ-HCHを添加して6つのウェルプレートでHepG2細胞を増殖させる。0.5ミリリットル0.25%EDTAで37°Cで1分間消化して細胞を収集します。
1ミリリットルDMEMを加え、消化を止め、消化した細胞を1.5ミリリットルのチューブに移します。チューブをGの1000倍の3分間遠心し、上清を捨てます。細胞ペレットを0.5ミリリットルの細胞培養培地と0.5ミリリットルのJC1ミトコンドリア膜電位色素で希釈します。
そして、摂氏37度で20分間インキュベートします。次に、チューブを600倍Gで摂氏4度で3分間遠心し、次にテキストプロトコルに従って細胞ペレットを洗浄する。洗浄したペレットを遠心した後、上清を取り除く。
そして、ペレットをJC1染色バッファーの0.5ミリリットルに再懸濁した。フローサイトメトリーを介してJC1染色細胞を分析し、緑色および赤色の蛍光を検出します。JC1モノマーが検出されたら、励起光を490ナノメートル、発光光を530ナノメートルに設定します。
JC1ポリマーが検出されたら、励起光を525ナノメートル、発光光を590ナノメートルに設定します。酸素消費率を分析するために、ヘプG2細胞を96ウェル細胞培養プレートに4,500細胞/ウェル当たり100マイクロリットルの密度で播種します。摂氏37度で24時間のインキュベーションの後、各ウェルの細胞が培地で覆われていることを確認してください。
OCRソフトウェアを実行する前に、テキストプロトコルに記載されているように、カートリッジと細胞培養プレートをマイクロプレートに細胞外フラックスアナライザにロードします。OCRソフトウェアを開き、アプリのドロップダウンメニューでセルの「ミトストレステストキット」を選択し、アプリの開始ボタンをクリックします。次に、[ストレス テストの実行] ボタンをクリックします。
細胞ストレステスト画面が表示されたら、細胞の播種数ボックスにウェル当たりの細胞播種数を入力し、基底細胞OCRボックスでの平均OCRを平均値に入力します。各試薬の最終作業濃度を入力し、試薬を注入します。次のボタンをクリックします。
グループ情報画面が表示されたら、色を選択して名前を付けることで、割り当てられていないウェルにグループを割り当てます。その後、適切な井戸をクリックします。次のボタンをクリックし、表示されるストレス テストインジェクション レイアウト画面で、[開始] をクリックして、アナライザでストレス テストを実行します。
実行が完了したら、ソフトウェアの指示に従い、カートリッジとセルプレートを取り外して廃棄します。β-HCHに曝露したHepG2細胞におけるミトコンドリア緑色蛍光染色の平均強度が低下した。これは、ミトコンドリア数の減少と農薬濃度の増加と一致する損傷したミトコンドリアの増加があることを示しています。
さらに、HepG2細胞におけるATPレベルはβ-HCH曝露の濃度の増加とともに減少し、これらの細胞におけるミトコンドリアの機能低下を示す。ミトコンドリア膜電位、またはMMPに対するJC1染色後、フローサイトメーターは、無傷のHepG2細胞において高赤色緑色JC1蛍光を示した。これは、高いMMPの兆候である赤色蛍光JC1凝集体の存在によるものであった。
β-HCHで処理した細胞において、緑色のJC1モノマーの存在により赤緑色JC1蛍光が低下し、低MMPの徴候である。最後に、β-HCH曝露の濃度の増加に伴って酸素消費率も低下し、この農薬が適切なミトコンドリア機能を損なうことをさらに示す。ああ、まあ、この手順を試みて、しかし、それをテストするために適切なセルを見ることを忘れないでください。
その開発後、これは間違いなくそれに関連する医学的役割の関連する生物を探求する基本的な機能の分野での研究のための道を開きます。このビデオを見た後、あなたは、不足シート機能の下で、量や品質、容量、今メンバーまたは潜在的なを検出する方法をよく理解している必要があります。
