오십견 쥐 모델의 Tuina: 효율적이고 재현 가능한 프로토콜

요약

이 연구는 쥐 모델에서 확립된 오십견 치료를 위한 효율적이고 재현 가능한 Tuina 프로토콜을 개발합니다. 이 접근법은 오십견에 대한 투이나 요법 치료 방법을 연구하는 데 도움이 될 것입니다.

초록

오십견(FS)은 최적의 치료법이 정의되어 있지 않은 흔한 질환입니다. 중국 병원에서 FS 환자를 치료하는 데 사용되는 전통 한의학(TCM) 기술인 투이나 요법은 우수한 결과를 보였지만 그 메커니즘은 완전히 이해되지 않았습니다. 이전 연구를 기반으로 한 이 연구는 FS 쥐 모델을 위한 Tuina 프로토콜을 개발하는 것을 목표로 했습니다. 무작위로 20마리의 SD 쥐를 대조군(C; n=5), FS 모델(M; n=5), FS 모델 투이나(Tuina) 치료군(MT; n=5), FS 모델 경구치료(MO; n=5) 그룹으로 나눴다. 본 연구는 캐스트 고정화 방법을 사용하여 FS 랫트 모델을 확립하였다. Tuina와 경구용 덱사메타손이 상완골 운동 범위(ROM)에 미치는 영향을 평가하고 조직학적 소견을 평가했습니다. 본 연구는 투이나와 경구용 덱사메타손이 어깨 활성 ROM을 개선하고 캡슐의 구조를 보존할 수 있음을 보여주었으며, 투이나 요법이 경구용 덱사메타손보다 더 효과적인 것으로 입증되었습니다. 결론적으로, 본 연구에서 확립된 Tuina 프로토콜은 FS에 매우 효과적이었습니다.

서문

오십견(FS)은 어깨 유착성 관절낭염으로도 알려져 있으며, 어깨 통증과 이동성 장애를 특징으로 하는 자가 제한 질환입니다. 일반적으로 30세에서 70세 사이의 사람들에게 영향을 미치며, 평균 연령은 50세이며, 중국 인구에서 약 5%의 유병률을 보입니다¹. 여성은 남성에 비해 FS 발병률이 1.6배 더 높은 것으로 보고되고^{있다 2}. FS의 유병률은 당뇨병, 포도당 및 지질 대사 장애 또는 기타 관련 질병이 있는 사람에서 10%에서 36% 사이로 더 높습니다^2,3. FS의 현재 임상 치료에는 물리 치료, 스테로이드 약물 및 수술 치료가 포함됩니다⁴.

중국 전통 의학(TCM) 요법인 투이나(Tuina)는 FS 환자의 어깨 통증을 효과적으로 완화하여 삶의 질을 향상시키는 것으로 나타났습니다 ^5,6. 그러나 이 치료법의 근본적인 메커니즘은 잘 알려져 있지 않습니다. 따라서 FS 치료에 대한 Tuina의 효과와 메커니즘을 연구하기 위해 동물 모델을 사용하는 것이 중요합니다.

쥐 어깨 관절은 인간의 어깨와 유사한 복잡한 구조를 가지고 있으며 FS⁷의 기계론적 연구에 자주 사용됩니다. FS 랫트 모델은 상완골 ROM과 캡슐 섬유증의 감소를 특징으로 한다⁸. 또한, 이 모델은 어깨 캡슐의 관찰을 가능하게 하고 부상을 치료하는 동안 병리학적 연구를 가능하게 한다⁹. 또한, 경구용 코르티코스테로이드는 FS 치료 연구에서 대조군으로 자주 사용된다¹⁰. 본 연구는 FS 랫트 모델에 대한 투이나 프로토콜을 개발하는 것을 목표로 하며, 투이나 요법과 경구용 덱사메타손의 효능을 비교하여 투이나 연구에서 동물실험 수행의 타당성을 입증하는 것을 목표로 한다.

프로토콜

이 연구는 Shandong University of Traditional Chinese Medicine 부속병원 윤리위원회의 승인을 받았습니다(번호: AWE-2022-023).

1. 실험동물

1. 20마리의 수컷 Sprague-Dawley(SD) 쥐(생후 7주, 250-280g)를 표준 조건(실온[RT] 20-24°C, 습도 40%-60%, 12시간/12시간 명암주기)에 수용했습니다.

2. 그룹화 방법

1. SD 랫트를 각각 5마리의 랫트로 구성된 대조군(C), FS 모델 대조군(M), FS 모델 투이나 치료군(MT) 및 FS 모델 경구 치료군(MO)으로 그룹화합니다. 케이지 당 5 마리의 쥐를 유지하십시오 (같은 그룹).
2. 7일간의 적응 후, 다음 섹션에 설명된 대로 FS를 모방하기 위해 3주 동안 석고 캐스트 고정을 사용하여 M, MT 및 MO 그룹의 쥐의 한쪽 어깨를 고정합니다.
3. 섹션 4(그림 1)에 설명된 대로 MT 그룹의 쥐에게 2주 동안 Tuina 요법을 투여합니다.
4. 성체 투여량(0.0675mg/일)과 인체 표면적(0.018)에 대한 쥐의 비율(0.018)을 기준으로 쥐 1kg당 덱사메타손의 필요한 투여량을 계산합니다.
5. 2주 동안 오전 0.067시에 오전 00시에 MO 그룹의 쥐에게 매일 위내 덱사메타손 용액을 투여합니다.
   참고: 이 그룹화 방법을 사용하여 이 연구에서 Tuina 프로토콜의 효과를 확인합니다. 다른 연구에서 실험 목적에 따라 그룹화 방법을 수행합니다.

3. FS 모델 개발

1. 트리브로모에탄올(250mg/kg, 복강내 주사)을 사용하여 쥐를 마취합니다.¹¹.
   참고: 기관 윤리 위원회의 요구 사항에 따라 트리보모에탄올(10g)과 tert-아밀 알코올(10mL)로 구성된 원액을 4°C에서 보관했습니다.  사용하기 전에 증류수로 2 %로 희석했습니다.
2. 쥐의 오른쪽 어깨와 가슴에 석고를 적신 붕대를 붙이고 오른쪽 앞다리를 어깨 관절의 내부 회전 90°로 3주 동안 유지합니다(그림 2)¹².
   알림: 쥐를 모니터링하여 걷기, 먹기, 마시는 것과 같은 정상적인 생리적 활동을 수행할 수 있는지 확인합니다. 쥐가 정상적인 생리 활동을 수행할 수 없는 경우 석고 붕대를 다시 고정하십시오.
3. 쥐에서 오른쪽 어깨 관절의 경직, 오른쪽 상지의 수축, 근육 위축, 절뚝거림과 같은 증상의 발달을 관찰하여 FS 모델의 성공적인 확립을 확인한다¹³.

4. 투이나 방법

알림: 절차 전반에 걸쳐 조사관은 개인 보호 장비를 착용해야 합니다. 단 한 명의 전문 Tuina 의사만이 모든 조작을 수행해야 합니다(그림 3, 그림 4 및 그림 5).

1. 기계 수용기와 컴퓨터를 포함하는 지능형 마사지 기술 파라미터 결정 시스템으로 훈련합니다(그림 3A).
   1. 메카노레수용체(mechanoreceptor)에 대한 조작을 수행하고 소프트웨어를 통해 표시되는 세 방향의 힘 파라미터를 수행합니다(그림 3B).
   2. 엄지 손가락을 사용하여 0.5kg의 강도와 100-120회/분의 빈도로 회전 운동에서 회전 반죽 방법을 수행합니다(그림 3C).
   3. 엄지 손가락 끝을 사용하여 0.5kg의 강도로 포인트 프레싱 방법을 수행합니다(그림 3D).
   4. 4.1.2 및 4.1.3 단계에서 언급 한 기계식 디스플레이를 1 분 동안 유지하여 쥐에 대해 Tuina를 수행합니다.
2. 쥐가 진정될 때까지(~2분) 쥐를 잡습니다. 그런 다음 조작을 수행합니다. 쥐를 옆으로 누운 자세로 놓지만 다른 조작 방법에 따라 위치가 바뀔 수 있습니다.
3. 오른쪽 검지와 중지를 사용하여 쥐의 오른쪽 앞다리를 고정하고 여러 번 구부리고 펴서 쥐의 어깨 관절, 팔꿈치 관절 및 상완골의 위치를 결정합니다.
4. 쥐의 오른쪽 어깨, 앞다리 및 등을 0.5kg의 강도와 100-120회/분의 빈도로 3분 동안 시계 방향으로 돌려 반죽합니다(그림 4A-C).
   1. 옆으로 누운 자세에서 앞다리 근육을 조작합니다.
   2. 엎드린 자세에서 어깨와 등 근육을 조작합니다.
5. 엄지 손가락 끝으로 엄지 손가락 끝으로 경혈 LI15(Jianyu), SI11(Tianzong), HT01(Jiquan) 및 LI11(Quchi)을 0.5kg의 강도로 경혈당 30회 수직으로 누릅니다(그림 4D-G).
   1. rat-acupoint 아틀라스를 사용하여 각 경혈의 위치를 정의합니다(그림 5)^14,15.
   2. 엎드린 자세에서 견봉 끝의 앞쪽 아래쪽 함몰부에 위치한 LI15를 누릅니다.
   3. 엎드린 자세에서 견갑골 척추의 중간 지점에 있는 극하외근(infraspinatus fossa)의 함몰부에 위치한 SI11을 누릅니다.
   4. 겨드랑이 중앙에 위치한 HT01을 누운 자세로 누릅니다.
   5. 측면 누운 위치에서 입방체 주름의 측면 끝에 있는 신근 carpi radialis의 내측 함몰부에 위치한 LI11을 누릅니다.
6. 왼쪽 엄지와 중지로 어깨 관절을 잡고 내전, 외전, 전방 신전 및 후방 신전 위치에서 앞다리를 10초 동안 스트레칭합니다(그림 4H-K).
   알림: 이 스트레칭 방법은 쥐에서 저항 없이 수행해야 합니다.
7. 쥐가 동요하면 Tuina 절차를 일시 중지하십시오. 쥐를 10초 동안 쓰다듬어 진정시킨 다음 시험을 진행합니다.
8. 2주 동안 매일 시술을 수행하십시오.

5. 상완골 ROM 측정

알림: 관절낭 조직의 변성을 방지하기 위해 가능한 한 빨리 측정 프로세스를 완료하는 것이 중요합니다.

1. 견갑골의 아래쪽 가장자리를 노출시킨 후 트리브로모에탄올(복강 내 주사에 의한 초기 용량의 3배)을 과도하게 투여하여 쥐를 희생한 후 견갑골과 상완골 근위 2/3를 제거합니다.
2. 주사 바늘(1.2cm x 0.45mm)을 상완골 샤프트를 따라 상완골두에 삽입합니다.
3. 멸균 수술 시트로 감싼 플라스틱 폼에 견갑골의 상하 모서리에 두 개의 주사 바늘을 수직으로 삽입합니다.
4. 상완골축의 주입 바늘에 가는 실을 붙이고 반대쪽 끝을 5g의 힘으로 당겨 상완골축과 평행이 되도록 합니다. 견갑골의 아래쪽 가장자리와 상완골 축(humeral shaft) 사이의 각도를 측정합니다(그림 6).
   알림: 신뢰할 수 있는 결과를 얻으려면 별도의 조사관이 측정을 수행하도록 하십시오.
5. 통계 분석 소프트웨어 응용 프로그램을 사용하여 평균 ± 표준 편차(SD)로 데이터를 보고합니다.
   참고: 여기서는 SPSS 소프트웨어(SPSS, 버전 25.0)가 사용되었습니다.
6. 일원 분산 분석(ANOVA)을 사용하여 그룹 간의 차이를 분석합니다.
7. 적절한 소프트웨어를 사용하여 막대 그래픽을 얻습니다.
   참고: 여기서는 GraphPad Prism 8을 사용했습니다.
8. 측정 후 H&E 및 Masson 염색을 사용하여 캡슐 병리를 평가합니다.

6. 섹션 준비

1. 상완골 ROM을 평가한 후 전체 샘플을 4% PFA에 3일 동안 고정한 다음 EDTA(pH 7.2) 용액에서 추가로 2개월 동안 석회질을 제거합니다.
2. 탈수 후 샘플이 포함된 임베디드 조직 블록을 5μm 슬라이스¹⁶로 자릅니다.
3. 슬라이스를 65°C에서 60분 동안 건조시킵니다.
4. 슬라이스를 왁스를 제거합니다.
5. 슬라이스를 크실렌 I, 크실렌 II 및 크실렌 III에 7분 동안 담근 다음 하강 에탄올 시리즈(무수 에탄올, 5분, 95% 에탄올, 2분, 80% 에탄올, 2분 및 70% 에탄올, 2분)를 넣고 마지막으로 초순수에 2분 동안 담그십시오.

7. H&E 염색

1. 헤마톡실린을 사용하여 섹션을 5분 동안 염색하고 1% 염산 에탄올로 3초 동안 헹구고 흐르는 물로 5분 동안 세척합니다.
2. 에오신으로 부분을 3분 동안 얼룩지게 하고 수돗물로 씻습니다.
3. 섹션을 에탄올 시리즈(95% 에탄올 I, 3초, 95% 에탄올 II, 3초, 무수 에탄올 I, 3초 및 무수 에탄올 II, 1분)에 담근 다음 크실렌 시리즈(크실렌 I, 1분, 크실렌 II, 1분)에 담근다.
4. 각 샘플에 중성 껌 실런트 한 방울을 떨어뜨립니다. 커버 유리로 각 샘플을 밀봉합니다.
5. 도립 형광 현미경(스케일 바 = 100μm)을 사용하여 이미지를 수집합니다.

8. 메이슨 염색

1. 면역조직화학 펜을 사용하여 절편 주위에 원을 그린 다음 절편을 37°C에서 2시간 동안 Bouin의 용액에서 매염제로 배양합니다. 그런 다음 노란색이 사라질 때까지 섹션을 물로 씻으십시오.
2. 샘플을 청금석 파란색 염료로 3분 동안 처리한 다음 증류수로 세척합니다.
3. 절편을 헤마톡실린(Mayer)으로 2분 동안 염색한 후, 산성 에탄올 분화 용액에서 절편을 3초 동안 처리한다. 그런 다음 흐르는 물에 10분 동안 섹션을 씻습니다.
4. ponceau 마젠타 염료 용액으로 섹션을 10분 동안 염색한 다음 물로 씻습니다.
5. 섹션을 포스 몰리브딕 산 용액에 10 분 동안 담그십시오.
6. 아닐린 블루 염색 용액을 섹션에 5분 동안 첨가한 다음 약산성 작업 용액으로 2분 동안 세척합니다.
7. 7.3단계에서 설명한 대로 섹션을 탈수하고 투명하게 만듭니다.
8. 각 부분에 중성 껌 밀봉제를 한 방울 떨어뜨리고 커버 유리로 덮습니다. 섹션을 흄 후드에 넣어 건조시키십시오.
9. 7.5단계에 설명된 대로 이미지를 수집합니다.

토론

첫 번째 중요한 단계는 모델 선택입니다. 1차 FS 모델을 구현하기 어렵기 때문에 캐스트 고정 및 외과적 내부 고정은 FS 쥐 모델 ^9,12을 설정하는 데 자주 사용됩니다. 캡슐의 어깨 이동성 및 섬유화의 가장 심각한 제한은 3주 동안 캐스트 고정화에 의해 확립된 FS 모델에서 관찰되었다^12,20. 이 연구에서 FS 모델의 성공률은 100%로 우수했습니다.

두 번째 중요한 단계는 이 프로토콜에서 사용되는 조작입니다. 이 연구에서는 세 가지 조작(주무르기, 누르기, 스트레칭)이 사용되었습니다. 연조직 주무르는 조작을 어깨, 견갑골 및 팔뚝에 적용하여 근육을 이완시켰습니다. 압착 조작은 FS ^5,21에 대한 임상 실습에서 가장 일반적으로 사용되는 LI15, SI11, HT01 및 LI11과 같은 경혈에 압력을 가하여 수행되었습니다. LI15, SI11 및 HT01은 어깨 캡슐 주변의 위치에 위치하며, ROM 및 어깨 기능을 개선하는데 효과적일 수^{있다 22}. LI11은 상지 운동 장애에 자주 사용되며 LI15와 같은 경락에 위치합니다. 이 경혈 매칭 방법은 LI15²³의 효능을 향상시키는 데 도움이 됩니다. 완전한 이완 후 스트레칭 기술을 사용하여 기능적 활동을 회복했습니다.

이 프로토콜에서 가능한 문제는 쥐가 투이나에서 강렬한 저항을 보인다는 것인데, 이는 쥐의 내성을 초과하기보다는 두려움으로 인해 발생할 수 있습니다. 이 시점에서 쥐가 진정될 때까지 조작을 중지해야 합니다(10초 동안 쓰다듬으면 쥐가 진정됨). 또한 스트레칭의 정도는 쥐의 증상에 따라 조정해야 합니다. 처음에는 어깨 관절의 한계가 분명했고 스트레칭 진폭이 작았습니다. 중재와 함께 쥐의 어깨 관절 기능이 점차 회복되고 스트레칭의 진폭이 점진적으로 증가했습니다. 쥐가 저항 없이 스트레칭 방법을 받아들일 수 있다는 것이 표준입니다. 마지막으로 쥐는 어느 정도의 공격성을 가지고 있으며 Tuina는 쥐와 장기간 접촉해야 하므로 개인 보호 장비를 착용하는 것이 중요합니다.

조작의 정량적 제어는 Tuina 실험에서 가장 어렵습니다. 마사지 조작 시뮬레이터는 단일 조작의 강도와 빈도를 제어하는 데 사용될 수 있지만, 이 방법은 여러 조작 및 치료 부위가 관련된 경우 제한된다^24,25. 임상에서 투이나는 일반적으로 의사가 직접 수행하는데, 이 연구에서는 의료 장비로 개입하기 어려웠다. 자극을 제어하기 위해 지능형 마사지 기술 매개 변수 결정 시스템을 사용하여 Tuina의 훈련을 표준화 할 수 있습니다. 훈련 후 조사관은 각 쥐에게 어느 정도 동일한 힘을 가할 수 있습니다. 이 프로토콜의 주요 제한 사항은 조작을 완전히 제어할 수 없다는 것입니다.

TCM Tuina 요법은 중국 전역에서 사용되어 온 풍부한 역사를 가지고 있으며, 병원의 다양한 의사가 다양한 조작 및 치료 부위 조합을 사용합니다. 따라서 동물 실험과 임상 연구 모두에 대해 재현 가능하고 효과적인 프로토콜을 수립하는 것이 중요합니다. 이 연구에서 사용된 조작 및 경혈은 우리 팀의 이전 연구를 기반으로 하여 임상 경험과 FS 동물 모델²¹의 특성을 결합했습니다. 이 연구는 FS 쥐의 어깨 관절 기능을 개선하고 캡슐 섬유증을 줄이는 데 개발된 Tuina 프로토콜의 효과를 입증했습니다. 이러한 발견은 투이나 치료의 기저에 있는 메커니즘에 대한 추가 조사를 위한 토대를 제공합니다. 또한, 이 프로토콜은 FS에 대한 대체 의학적 치료의 효능을 탐구하는 데 관심이 있는 연구자들에게 유용할 수 있습니다.

이전 연구에서는 섬유증에 대한 Tuina 중재 메커니즘이 MMP-1/TIMP-1의 균형을 조절하면서 TGF-β 및 CTGF의 하향 조절과 관련이 있을 수 있음을 발견하여 세포외 기질(ECM)의 생성을 완화할 수 있습니다²⁶. 어깨 캡슐의 섬유증에 대한 Tuina의 효과는 다양한 메커니즘의 조절을 통해 달성 될 수 있습니다. 그러나 이 개선과 관련된 메커니즘을 완전히 이해하려면 추가 연구가 필요합니다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
4% paraformaldehyde	Solarbio	P1110
Embedding machine	Changzhou Paisijie Medical Equipment Co., Ltd	BM450A
Ethylene Diamine Tetraacetic Acid (EDTA)	Solarbio	E1171
Hematoxylin eosin (HE) staining kit	Sparkjade	EE0012
Intelligent-massage technique parameter determination system	Shanghai Dukang Intrument Equipment Co. Ltd	ZTC-
Microtome	Leica	531CM-Y43
Modified Masson Trichrome Staining Solution	Shanghai yuanye Bio-Technology Co., Ltd	R20381-8	Bouin 50 mL; lapis lazuli blue dye 50 mL; Hematoxylin (Mayer) 50 mL; acidic ethanol differentiation solution 50 mL; ponceau magenta dye solution 50 mL; phosphomolybdic acid solution 50 mL; aniline blue staining solution 50 mL;  weak acid 50 mL
Tribromoethanol	Macklin	T903147-5