GMP 등급의 용해성 다공성 마이크로캐리어를 기반으로 한 대규모 셀 생산

요약

여기에서는 GMP 등급의 용해성 마이크로캐리어를 기반으로 하는 완전 폐쇄형 시스템을 통해 부착 세포의 대규모 제조를 달성하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 인간 중간엽 줄기 세포, HEK293T 세포 및 Vero 세포의 배양은 검증되었으며 세포 및 유전자 치료 산업의 수량 요구와 품질 기준을 모두 충족했습니다.

초록

세포 및 유전자 치료(CGT) 산업의 연구자들은 세포의 효율적이고 대규모적인 확장이라는 만만치 않은 과제에 오랫동안 직면해 왔습니다. 2차원(2D) 평면 배양 시스템의 주요 단점을 해결하기 위해 인간 중간엽 줄기/기질 세포(hMSC), HEK293T 세포 및 Vero 세포를 포함한 부착 세포의 3D 배양을 위한 GMP 등급의 용해성 다공성 마이크로캐리어를 기반으로 하는 자동 폐쇄형 산업 규모 세포 생산(ACISCP) 플랫폼을 혁신적으로 개발했습니다. 대규모 확장을 달성하기 위해 5L 및 15L 교반 탱크 바이오리액터로 2단계 확장을 수행하여 9일 이내에 전체 128배 팽창으로 1.1 x 10¹⁰ hMSC를 생산했습니다. 세포는 마이크로캐리어를 완전히 용해시켜 수거하고, 농축하고, 세척하고, 연속 흐름 원심분리기 기반 세포 처리 시스템으로 제형화한 다음, 세포 충전 시스템으로 분주하였다. 2D 평면 배양과 비교했을 때, 3D 배양에서 채취한 hMSC의 품질에는 큰 차이가 없습니다. 우리는 또한 이러한 용해성 다공성 마이크로캐리어를 CGT 부문의 다른 인기 있는 세포 유형에도 적용했습니다. 구체적으로, HEK293T 세포 및 Vero 세포는 각각 1.68 x 10 7 cells/mL 및 1.08 x 10⁷ cells/mL의 피크 세포 밀도로 배양되었습니다. 이 연구는 부착 세포의 산업 규모 제조를 달성하기 위해 GMP 등급 용해성 마이크로캐리어 및 고급 폐쇄 장비의 특성을 활용하는 바이오프로세스 엔지니어링 플랫폼을 사용하기 위한 프로토콜을 제공합니다.

서문

CGT 산업은 지난 20년 동안 기하급수적으로 확장되었습니다. 차세대 의약품의 발전은 수많은 난치성 질환을 치료하고 완치할 것으로 예상됩니다¹. 2017년 미국 식품의약국(FDA)이 CGT 제품인 킴리아(Kymriah)를 최초로 승인한 이후, 전 세계적으로 CGT 관련 연구 개발은 빠른 속도로 계속 성장하고 있으며, FDA는 CGT에 대한 활발한 임상시험용 신약 신청이 2018년에 500건으로 증가했다고 밝혔다². 2030년까지 미국에서 CGT 제품의 승인 건수는 54-74건이 될 것으로 예측되었다².

CGT 연구 및 혁신의 급속한 성장은 흥미진진하지만, 저렴한 비용으로 필요한 만큼 많은 환자에게 도달할 수 있는 유망한 의약품을 제공할 수 있는 실험실 연구와 산업 규모 제조 사이에는 여전히 큰 기술 격차가 있습니다. 이러한 임상시험에 채택된 현재 공정은 소규모 실험을 위해 실험실에서 확립되었으며, CGT 제조를 개선하고 혁신하기 위해서는 상당한 노력이 필요하다³. CGT 제품에는 여러 유형이 있으며, 대부분은 동종 세포, 자가 세포, 엔지니어링 또는 천연 세포를 기반으로 합....

프로토콜

인간 탯줄은 베이징 칭화 창겅 병원에서 입수했습니다. 인간 탯줄 중간엽 줄기세포(UCMSC)의 획득, 분리 및 배양에 관한 모든 절차와 프로토콜은 정보에 입각한 동의와 베이징 칭화창겅 병원 윤리 위원회(출원 번호 22035-4-02)의 승인을 받아 수행되었으며, 절차와 프로토콜은 1964년 헬싱키 선언 및 이후 개정안 또는 이에 상응하는 윤리 기준을 준수했습니다.

1. hMSC, HEK293T 세포 및 Vero 세포의 단층 배양

1. 보고된 방법²¹에 따라 Wharton's jelly에서 1차 인간 UCMSC를 분리합니다. 일차 UCMSC의 분리 및 증식을 위해 무혈청(SF) hMSC 배양 배지를 사용하고, 통로 2에서 세포를 수확하고, 마스터 세포 은행(MCB)으로 냉동 보존합니다.
2. 단층 배양을 위해 하나의 T75 플라스크에 6 x 10⁵ 개의 인간 UCMSC(바람직하게는 통로 2 또는 통로 3 세포)를 15mL의 완전한 SF hMSC 배양 배지로 접종합니다(즉, 2D 평면 용기의 파종 밀도는 8,000 cells/^cm2). 플라스크의 8자 이동을 통해 균일한 파종을 보장합니다. 37°C에서 5%

토론

면역 요법과 줄기 세포 요법 모두 살아있는 세포를 약물로 사용합니다. 그러나 최종 제품은 저분자 또는 바이러스와 같은 방식으로 정제하거나 멸균해서는 안 됩니다. 그러므로, QbD(Quality by Design)의 원칙은 항상 염두에 두어야 하며, 셀 생산 중 화학 제조 및 제어(CMC) 공정에 실질적으로 적용되어야 한다²³. 완전 폐쇄형 세포 배양 시스템, 처리 시스템 및 충전 시스템은 요구 사항?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% trypsin EDTA	BasalMedia	S310JV	Used for 2D cell harvest.
3D FloTrix Digest	CytoNiche Biotech	R001-500	This is a reagent that specifically dissolves 3D TableTrix microcarriers.
3D FloTrix MSC Serum Free Medium	CytoNiche Biotech	RMZ112	This is a serum-free,animal-free medium for mesenchymal stem cell expansion and maintenance in 2D planar culture as well as 3D culture on 3D TableTrix microcarriers.
3D FloTrix Single-Use Filtration Module	CytoNiche Biotech	R020-00-10	This module contains 0.22 μm capsule filters used for filtration of culture medium and digest solution.
3D FloTrix Single-Use Storage Bag (10 L)	CytoNiche Biotech	R020-00-03	Used as feed bag for 5 L bioreactor.
3D FloTrix Single-Use Storage Bag (3 L)	CytoNiche Biotech	R020-00-01	Used as cell seeding or transfer bags.
3D FloTrix Single-Use Storage Bag (50 L)	CytoNiche Biotech	R020-00-04	Used as feed bag for 15 L bioreactor.
3D FloTrix vivaPACK Disposable Fill&Finish Consumable Kit	CytoNiche Biotech	PACK-01-01	This is a standard kit adapted to 3D vivaPACK fill and finish system.
3D FloTrix vivaPACK fill and finish system for cells	CytoNiche Biotech	vivaPACK	This system is a closed liquid handling device, with automated mixing and gas exhausting functions. Cells resuspended in cryopreservation buffer can be rapidly and evenly aliquoted into 20 bags per batch.
3D FloTrix vivaPREP PLUS cell processing system	CytoNiche Biotech	vivaPREP PLUS	This system is a continuous flow centrifuge-based device.Cells can be concentrated, washed, and resuspended under completely closed procedures.
3D FloTrix vivaPREP PLUS Disposable Cell Processing Kit	CytoNiche Biotech	PREP-PLUS-00	This is a standard kit adapted to 3D vivaPREP PLUS cell processing.
3D FloTrix vivaSPIN  bioreactor 15 L	CytoNiche Biotech	FTVS15	This bioreactor product employs a controller, a 15 L glass stirred-tank vessel, and assessories. A special perfusion tube is available.
3D FloTrix vivaSPIN  bioreactor 5 L	CytoNiche Biotech	FTVS05	This bioreactor product employs a controller, a 5 L glass stirred-tank vessel, and assessories.A special perfusion tube is available.
3D FloTrix vivaSPIN Closed System Consumable Pack (10/15 L)	CytoNiche Biotech	R020-10-10	This is a standard tubing kit adapted to 3D vivaSPIN bioreactor 15 L, containing sampling bags.
3D FloTrix vivaSPIN Closed System Consumable Pack (2/5 L)	CytoNiche Biotech	R020-05-10	This is a standard tubing kit adapted to 3D vivaSPIN bioreactor 5 L, containing sampling bags.
3D TableTrix microcarriers G02	CytoNiche Biotech	G02-10-10g	These porous and degradable microcarriers are suitable for HEK293T cell culture. They come pre-sterilized in 10g/bottle with C-Flex tubings for welding to tubes on bioreactors.
3D TableTrix microcarriers V01	CytoNiche Biotech	V01-100-10g	These porous and degradable microcarriers are suitable for adherent cell culture, they come as non-sterilized microcarriers that need to be autoclaved in PBS before use. They are especially suitable for vaccine production.
3D TableTrix microcarriers W01	CytoNiche Biotech	W01-10-10g (single-use packaging); W01-200 (tablets)	These porous and degradable microcarriers are suitable for adherent cell culture, especially for cells that need to be harvested as end products. They come pre-sterilized in 10g/bottle with C-Flex tubings for welding to tubes on bioreactors.The product has obtained 2 qualifications for pharmaceutical excipients from CDE, with the registration numbers of [F20200000496; F20210000003]. It has also received DMF qualification for pharmaceutical excipients from FDA, with the registration number of [DMF:35481]
APC anti-human CD45 Antibody	BioLegend	368512	Used in flow cytometry for MSC identity assessment
Calcein-AM/PI Double Staining Kit	Dojindo	C542	Calcein-AM/PI Double Staining Kit is utilized for simultaneous fluorescence staining of viable and dead cells. This kit contains Calcein-AM and Propidium Iodide (PI) solutions, which stain viable and dead cells, respectively.
Cap for EZ Top Container Closures for NALGENE-containers (500mL)	Saint-Gobain	CAP-38	Brands and catalogue numbers are only for example, similar products are available from various suppliers and as long as they have the same functionality, items could be substituted with other brands.
C-Flex Tubing, Formulation 374 (0.25 in x 0.44 in)	Saint-Gobain	374-250-3	Used for tube welding and disconnection.
CryoMACS Freezing Bag 50	Miltenyi Biotec	200-074-400	Used for expanding the 3D FloTrix vivaPACK Disposable Fill&Finish Consumable Kit.
Dimethyl Sulfate (DMSO)	Sigma	D2650-100mL	Used for preparation of cryopreservation solution.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	BasalMedia	L120KJ	Used for cultivation of HEK293T and Vero cells.
DURAN Original GL 45 Laboratory bottle (2 L)	DWK life sciences	218016357	Used for waste collection from the 5 L bioreactor.
DURAN Original GL 45 Laboratory bottle (5 L)	DWK life sciences	218017353	Used for waste collection from the 15 L bioreactor.
DURAN Original GL 45 Laboratory bottle (500 mL)	DWK life sciences	218014459	Used for supplementary bottle of 0.1 M NaOH.
EZ Top Container Closures for NALGENE-containers (500mL)	Saint-Gobain	EZ500 ML-38-2	Brands and catalogue numbers are only for example, similar products are available from various suppliers and as long as they have the same functionality, items could be substituted with other brands.
Fetal bovine serum (FBS) superior quality	Wisent	086-150	Used for cultivation of HEK293T cells.
FITC anti-human CD14 Antibody	BioLegend	301804	Used in flow cytometry for MSC identity assessment.
FITC anti-human CD34 Antibody	BioLegend	343504	Used in flow cytometry for MSC identity assessment.
FITC anti-human CD90 (Thy1) Antibody	BioLegend	328108	Used in flow cytometry for MSC identity assessment.
Flow cytometry	Beckman Coulter	CytoFLEX	Used for cell identity assessment.
Fluorescence Cell Analyzer	Alit life science	Countstar Rigel S2	Used for cell counting. Cell viability can be calculated by staining with AO/PI dyes.
GL 45 Multiport Connector Screw Cap with 2 ports	DWK life sciences	292632806	Brands and catalogue numbers are only for example, similar products are available from various suppliers and as long as they have the same functionality, items could be substituted with other brands.
Glucose Meter	Sinocare	6243578	Used for detecting glucose concentration in cell culture medium and supernatant.
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS), with calcium and magnesium	Gibco	14025092	Used for preparation of digest solution.
Human Albumin 20% Behring (HSA)	CSL Behring	N/A	Used for preparation of wash buffer.
Inverted fluorescent microscope	OLYMBUS	CKX53SF	Used for brifgt field and fluorescent observation and imaging.
Nalgene Measuring Cylinder (500 mL)	Thermo Scientific	3662-0500PK	Used for calibrating the liquid handling volume speed of peristaltic pumps.
Newborn calf serum (NBS) superfine	MINHAI BIO	SC101.02	Used for cultivation of Vero cells.
OriCell human mesenchymal stem cell adipogenic differentiation and characterization kit	Cyagen	HUXUC-90031	Used for tri-lineage differentiation of hUCMSCs.
OriCell human mesenchymal stem cell chondrogenic differentiation and characterization kit	Cyagen	HUXUC-90041	Used for tri-lineage differentiation of hUCMSCs.
OriCell human mesenchymal stem cell osteogenic differentiation and characterization kit	Cyagen	HUXUC-90021	Used for tri-lineage differentiation of hUCMSCs.
PE anti-human CD105 Antibody	BioLegend	800504	Used in flow cytometry for MSC identity assessment.
PE anti-human CD19 Antibody	BioLegend	302208	Used in flow cytometry for MSC identity assessment.
PE anti-human CD73 (Ecto-5'-nucleotidase) Antibody	BioLegend	344004	Used in flow cytometry for MSC identity assessment.
PE anti-human HLA-DR Antibody	BioLegend	307605	Used in flow cytometry for MSC identity assessment.
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Wisent	311-010-CL	Used in autoclaving of glass vessel and V01 microcarriers, and replacement of culture medium.
Sani-Tech Platinum Cured Sanitary Silicone Tubing (0.13 in x 0.25 in)	Saint-Gobain	ULTRA-C-125-2F	Used for solution transfering driven by peristaltic pumps.
Sterile Saline	Hopebiol	HBPP008-500	Used for preparation of wash buffer.
Trypzyme Recombinant Trypsin	BasalMedia	S342JV	This reagent is used for bead-to-bead transfer of HEK293T and Vero cells.
Tube Sealer	Yingqi Biotech	Tube Sealer I	This sealer is compatible with both C-Flex tubing and PVC tubing.
Tube Welder for PVC tubing	Chu Biotech	Tube Welder Micro I	Used for welding of PVC tubing.
Tube Welder for TPE tubing	Yingqi Biotech	Tube Welder I-V2	Used for welding of TPE tubing.
ViaStain AO / PI Viability Stains	Nexcelom	CS2-0106-25mL	Dual-Fluorescence Viability, using acridine orange (AO) and propidium iodide (PI), is the recommended method for accurate viability analysis of primary cells, such as PBMCs, and stem cells in samples containing debris.