엑소좀이 함유된 콜라겐 패치 및 오프 펌프 관상동맥 우회술로 치료한 만성 심근 허혈의 외과적 돼지 모델

요약

본 연구는 진행성 관상동맥 협착증으로 인한 만성 심근허혈의 외과적 돼지 모델을 제시하여 경색 없이 심장기능 장애를 초래한다. 허혈 후 동물은 줄기세포 유래 엑소좀이 함유된 콜라겐 패치를 심외막 배치와 함께 오프펌프 관상동맥 우회술을 받습니다. 이 보조 요법은 심근 기능과 회복을 향상시킵니다.

초록

진행성 관상동맥 협착증으로 인한 만성 심근 허혈은 대사 활동을 감소시켜 산소 가용성 감소에 적응하여 돌이킬 수 없는 심근세포 손상 및 경색을 예방하는 심근으로 정의되는 동면 심근(HIB)으로 이어집니다. 이는 심근경색과는 구별되는데, HIB는 혈관재생술을 통해 회복될 가능성이 있기 때문입니다. 중증 관상동맥 질환(CAD)이 있는 환자는 만성 허혈을 경험하여 심부전과 돌연사의 위험에 처하게 됩니다. 중증 CAD에 대한 표준 외과적 치료는 관상동맥 우회술(CABG)이지만 불완전한 치료법으로 밝혀졌지만 만성 허혈에 적응한 근세포를 회복시키는 보조 요법은 존재하지 않습니다. 이러한 간극을 해소하기 위해 CABG에 적합하고 임상 시나리오를 모방하는 돼지를 사용한 HIB의 수술 모델이 사용되었습니다. 이 모델에는 두 가지 수술이 포함됩니다. 첫 번째 수술은 좌측 전방 하행(LAD) 동맥에 1.5mm 경직 수축근을 이식하는 것입니다. 동물이 성장함에 따라 수축근은 점차적으로 심각한 협착을 일으켜 국소 수축기 기능을 감소시킵니다. 협착증이 80%에 도달하면 심근의 흐름과 기능이 손상되어 HIB가 생성됩니다. 그런 다음 허혈성 부위를 혈관 재생하기 위해 좌측 내유방 동맥(LIMA)으로 오프 펌프 CABG를 수행합니다. 동물은 희생 전에 최적의 심근 개선을 위해 한 달 동안 회복합니다. 이를 통해 다양한 치료 그룹의 생리학적 및 조직 연구가 가능합니다. 이 동물 모델은 CABG에도 불구하고 심장 기능이 여전히 손상되어 있음을 보여주며, 이는 새로운 보조 중재의 필요성을 시사합니다. 본 연구에서는 중간엽줄기세포(MSC) 유래 엑소좀이 내장된 콜라겐 패치를 개발하여 LIMA 문합 원위 심외막에 외과적으로 적용할 수 있도록 하였습니다. 이 물질은 심외막에 순응하고 흡수성이 있으며 신호 전달 인자의 지속적인 방출을 위한 지지체를 제공합니다. 이 재생 요법은 혈관 재생만으로는 반응하지 않는 심근 회복을 자극할 수 있습니다. 이 모델은 HIB의 회복에 관한 생리학적 및 기계론적 탐구 수단을 제공함으로써 임상 분야로 전환됩니다.

서문

전 세계적으로 중증 CAD는 1억 명 이상의 환자에게 영향을 미치고 있으며, 사망률은 감소했지만 여전히 주요 사망 원인^{중 하나입니다 1,2}. CAD는 심근경색(MI)에서 생존력이 보존된 허혈에 이르기까지 광범위한 임상 스펙트럼을 가지고 있습니다. 대부분의 전임상 연구는 MI에 초점을 맞추고 있으며, 소동물 및 대형 동물 모델에서 연구할 수 있기 때문에 경색 조직의 존재를 특징으로 합니다. 그러나 이 모델은 생존력이 보존되고 혈관재생술이 가능한 환자를 다루지 않습니다. CABG를 받는 대부분의 환자는 혈액 공급이 감소하고 기능이 제한되는 반면 수축 예비력과 생존력의 변동성은 유지된다³. 이러한 환자들은 치료를 받지 않으면 진행성 심부전과 돌연사로 진행될 수 있으며, 특히 업무량이 증가할 경우^{더욱 그렇다 4}. 이러한 환자들 중 관상동맥우회술(CABG)은 효과적인 치료법이지만 완전한 기능적 회복을 가져오지 못할 수 있다⁵. 중요한 것은 더 나쁜 임상 결과의 지표인 이완기 기능 장애가 혈관 재생술 후 회복되지 않는다는 것인데, 이는 CABG

프로토콜

미니애폴리스 VA 메디컬 센터(Minneapolis VA Medical Center)와 미네소타 대학교(University of Minnesota)의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)는 모든 동물 연구를 승인했습니다. 실험실 동물의 사용 및 관리에 대한 현재 NIH(National Institutes of Health) 지침을 따랐습니다.

1. 중간엽줄기세포의 분리와 엑소좀의 준비 및 특성분석

1. 골수 유래 중간엽 줄기세포(MSC) 분리
   1. 20주 된 암컷 요크셔 랜드레이스 돼지의 흉골 또는 경골에서 30-50mL의 멸균 골수를 얻습니다. 이를 위해 25mm 15G 골간 바늘을 흉골 또는 경골에 삽입하고 10mL의 헤파린이 포함된 60mL 주사기에 샘플을 채취합니다.
      참고: 골수 수집에 대한 자세한 내용은 Pittenger et al. 및 Hocum-Stone et ^al.12,16을 참조하십시오.
   2. 간단히 말해서, 골수 검체를 헤파린이 포함된 Vacutainer CPT 튜브를 통해 1800 x g에서 30분 동안 통과시킵니다.
   ....

토론

본 연구는 만성 허혈성 심근의 첫 번째 돼지 모델을 제시하며, 외과적 혈관재생술 중 MSC 유래 엑소좀 함유 콜라겐 패치로 치료하면 미토콘드리아 회복을 표적으로 하여 수축기 자극 시 이완기 및 수축기 기능이 회복되는 것으로 나타났습니다. 이전에 HIB의 대동물 모델에서 심장 MRI로 측정한 이완기 및 수축기 기능은 손상된 상태로 유지되며 완전한 회복 없이 혈관재생술을 통해 약간만 개선되는 ?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
5 Ethibond	Ethicon	MG46G	Suture
# 40 clipper blade	Oster	078919-016-701	Remove hair from surgery sites
0 Vicryl	Ethicon	J208H	Suture
1 mL Syringe	Medtronic/Covidien	1188100777	Administer injectable agents
1" medical tape	Medline	MMM15271Z	Secure wound dressing and IV catheters
1000mL 0.9% Sodium chloride	Baxter	2B1324X	IV replacement fluid
12 mL Syringe	Medtronic/Covidien	8881512878	Administer injectable agents
18 ga needles	BD	305185	Administration of injectable agents
20 ga needles	BD	305175	Administration of injectable agents
20 mL Syringe	Medtronic/Covidien	8881520657	Administer injectable agents
2-0 Vicryl	Ethicon	J317H	Suture
250 mL 0.9% saline	Baxter	UE1322D	Replacement IV Fluid
3 mL Syinge	Medtronic/Covidien	1180300555	Administer injectable agents
3-0 Vicryl	Ethicon	VCP824G	Suture
36” Pressure monitoring tubing	Smith’s Medical	MX563	Connect art. Line  to transducer
4.0 mm ID endotracheal tube	Medline	DYND43040	Establish airway for Hibernation
4-0 Tevdek II Strands	Deknatel	7-922	Suture to secure constrictor around LAD
48” Pressure monitoring tubing	Smith’s Medical	MX564	Connect art. Line  to transducer
500mL 0.9% Sodium chloride	Baxter	2B1323Q	Drug delivery, Provide mist for Blower Mister
6  mL Syringe	Medtronic/Covidien	1180600777	Administer injectable agents
6.0 mm ID endotracheal tube	Mallinckrodt	86049	Establish airway for Revasc,MRI and Termination
6.5 mm ID endotracheal tube	Medline	DYND43065	Establish airway for Revasc,MRI and Termination
6” pressure tubing line	Smith’s Medical	MX560	Collect bone marrow
60 mL Syringe	Medtronic/Covidien	8881560125	Administer injectable agents
7.0 mm ID endotracheal tube	Medline	DYND43070	Establish airway for Revasc,MRI and Termination
7-0 Prolene	Ethicon	M8702	Suture
Advanced DMEM (1X)	ThermoFisher Scientific	12491023
Alcohol Prep pads	MedSource	MS-17402	Skin disinfectant
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit	Millipore Sigma	UFC910024
Anesthesia Machine	Drager	Fabious Trio	maintains general anesthesia
Anesthesia Machine + ventilator	DRE Drager- Fabius Tiro	DRE0603FT	Deliver Oxygen and inhalant to patient
Anesthesia Monitor	Phillips  Intellivue	MP70	Multiparameter for patient safety
Arterial Line Kit	Arrow	ASK-04510-HF	Femoral catheter for blood pressure monitoring
Artificial Tears	Rugby	0536-1086-91	Lubricate eyes to prevent corneal drying
Bair Hugger	3M	Model 505	Patient Warming system
Basic pack	Medline	DYNJP1000	Sterile drapes and table cover
Blood Collection Tubes- green top	Fisher Scientific	02-689-7	Collect microsphere blood samples
Blower Mister Kit	Medtronic/Covidien	22120	Clears surgical field for vessel anastomosis
BODIPY TR Ceramide	ThermoFisher Scientific	D7540
Bone marrow needle- 25mm 15 ga IO needle	Vidacare	9001-VC-005	Collect bone marrow
Bone Wax	Medline	ETHW31G	Hemostasis of cut bone
Bovie Cautery hand piece	Covidien	E2516	Hemostasis
Bupivicaine	Pfizer	00409-1161-01	Local Anesthetic
Buprenorphine 0.3 mg/mL	Sigma Aldrich	B9275	Pre operative Analgesic for survivial procedures
Cell Scrapers	Corning	353085
Cephazolin 1 gr	Pfizer	00409-0805-01	Antibiotic
Chest Tube	Covidien	8888561043	Evacuates air from chest cavity
Cloroprep	Becton Dickenson	260815	Surgical skin prep
Corning bottle-top vacuum Filter System (500mL)	Millipore Sigma	430758
CPT tube	BD	362753	MSC isolation from bone marrow
Delrin Constrictor	U of MN	Custom made	Creates stenosis of LAD
Dermabond	Ethicon	DNX12	Skin adhesive
DMEM (1X) Dulbecco's Modified Eagle Medium, HEPES	ThermoFisher Scientific	12430062
Dobutamine 12.5 mg/mL	Pfizer	00409-2344-01	Increases blood pressure and heart rate during the second microsphere blood collection
ECG Pads	DRE	1496	Monitor heart rhythm
Exosome-Depleted FBS	ThermoFisher Scientific	A2720801
Falcon Disposable Polystyrene Serological Pipets, Sterile, 10mL	Fisher Scientific	13-675-20
Femoral and carotid introducer	Cordis- J&J	504606P	femoral and carotis cannulas
Fetal Bovine Serum, Heat Inactivated, Gibco FBS	ThermoFisher Scientific	16140089
Flo-thru 1.0	Baxter	FT-12100	used to anastomos LIMA to L
Flo-thru 1.25	Baxter	FT-12125	FT-12125
Flo-thru 1.5	Baxter	FT-12150	FT-12150
Flo-thru 2.0	Baxter	FT-12200	FT-12200
GlutaMAX Supplement	ThermoFisher Scientific	35050061
Hair Clipper	Oster	078566-011-002	Remove hair from surgery sites
Helistat collagen sponge	McKesson	570973 1690ZZ	Sponge for embedding exosomes
Heparin	Pfizer	0409-2720-03	anticoaggulant
Histology Jars	Fisher Scientific	316-154	Formalin for tissue samples
HyClone Characterized Fetal Bovine Serum (FBS)	Cytiva	SH30071.03
Hypafix	BSN Medical	4210	Secure wound dressing and IV catheters
Isoflurane	Sigma Aldrich	CDS019936	General Anesthestic- Inhalant
IV Tubing for Blower Mister	Carefusion	42493E	Adapts to IV Fluids for Blower/Mister
Jelco 18 ga IV catheter	Smiths medical	4054	IV access in Revasc, MRI and Term
Lidocaine 2%	Pfizer	00409-4277-01	Local Anesthetic/ antiarrthymic
Ligaclips	Ethicon	MSC20	Surgical Staples for LIMA takedown
Long blade for laryngoscope	DRE	12521	Allows for visualization of trachea for intubation
Meloxicam 5 mg/mL	Boehringer Ingelheim	141-219	Post operative Analgesic
Microsphere pump			Collect blood samples from femoral introducer
Monopolar Cautery	Covidien	Valleylab™ FT10	Hemostasis
Nanosight NS 300	Malvern Panalytical	MAN0541-03-EN
NTA 3.1.54 software	Malvern Panalytical	MAN0520-01-EN-00
OPVAC Synergy II	Terumo Cardiovascular System	401-230	Heart positioner and Stabilizer
Oxygen Tank E cylinder	various	various	Used for Blower Mister if anesthesia machine doesn't have auxiliary flow meter
PBS, pH 7.2	ThermoFisher Scientific	20012050
Penicillin-Streptomycin-Neomycin (PSN) Antibiotic Mixture	ThermoFisher Scientific	15640055
Pigtail 145 catheter 6 French	Boston Scientific	08641-41	Measure LV pressures
Pressure Transducer	various	Must adapt to anesthesia monitor	Monitor direct arterial pressures
Propofol	Diprivan	269-29	Induction agent
Roncuronium	Mylan	67457-228-05	Neuromuscular blocking agent
SR Buprenorphine 10 mg/mL	Abbott Labs	NADA 141-434	Post operative Analgesic
Sterile Saline 20 mL	Fisher Scientific	20T700220	Flush for IV catheters
Sternal Saw/ Necropsy Saw	Thermo Fisher	812822	Used to open chest cavity
Stop Cocks	Smith Medical	MX5311L	2 to connect to pig tail
Succinylcholine 20 mg/mL	Pfizer	00409-6629-02	Neuromuscular blocking agent
Suction  tubing	Medline	DYND50223
Suction Container	Medline	DYNDCL03000
Surgery pack with chest retractor	various	See pack list	Femoral cut down and median sternotomy
Surgical Instruments	various	See pack list	Femoral and carotid cutdowns and sternotomy
Surgical Spring Clip	Applied Medical	A1801	Clamp end of LIMA after takedown
Syringe pump	Harvard		Delivers IV Dobutamine infusion
SYTO RNASelect Green Fluorescent cell Stain - 5 mM Solution in DMSO	Millipore Sigma	S32703
Telazol 100 mg/mL	Fort Dodge	01L60030	Pre operative Sedative
Telpha pad	Covidien	2132	Sterile wound dressing
Timer			Time collection of blood samples
Total Exosome Isolation Reagent (from cell culture media)	ThermoFisher Scientific	4478359
TPP Tissue Culture Flask, T75, Filter Cap w/ 0.22uM PTFE	ThermoFisher Scientific	TP90076
Triple Antibiotic Ointment	Johnson & Johnson	23734	Topical over wound
Vicryl mesh	Ethicon	VKML	Patch for epicardial cell application
Vortex			Mix microspheres
Xylazine 100 mg/mL	Vedco	468RX	Pre operative Sedative/ analgesic