녹농균(Pseudomonas aeruginosa)에 의해 생산된 Mono-Rhamnolipids 및 Di-Rhamnolipids의 검출 및 정량화

요약

녹농균(Pseudomonas aeruginosa)은 람놀리피드 생물 계면활성제를 생산합니다. 박층 크로마토그래피는 각 균주에 의해 생성된 mono- rhamnolipid와 di-rhamnolipid의 비율을 검출하고 측정합니다. 총 람놀리피드의 정량화에는 오르시놀 방법을 사용하여 배양 상층액에서 추출한 이러한 생물계면활성제에 존재하는 람노스 등가물을 평가하는 것이 포함됩니다.

초록

환경 박테리아 녹농균(Pseudomonas aeruginosa )은 항생제 내성이 높아 건강에 위험을 초래하는 기회 감염 병원체입니다. 이 박테리아는 람놀라이피드(RL)로 알려진 생물 계면활성제를 고농도로 생성하는데, 이 계면활성제는 생명공학적 가치가 있는 분자이지만 독성 특성과도 관련이 있습니다. 이러한 점에서, RL의 검출 및 정량화는 생명공학 응용 분야와 생물 의학 연구 프로젝트 모두에 유용할 수 있습니다. 이 기사에서는 박층 크로마토그래피(TLC)를 사용하여 녹농균에 의해 생성되는 두 가지 형태의 RL의 생성을 검출하는 기술을 단계별로 보여줍니다: 단일 람인지질(mRL), 하나의 람노스 부분에 연결된 지방산 이량체(주로 C10-C10)로 구성된 분자 및 두 개의 람노스 부분에 연결된 유사한 지방산 이량체로 구성된 분자인 디-람놀리피드(dRL). 또한, 녹농 균 배양 상층액에서 추출한 이러한 생물계면활성제의 산 가수분해와 오르시놀과 반응하는 람노스 농도의 후속 검출을 기반으로 RL의 총량을 측정하는 방법을 제시합니다. 두 기법의 조합은 유형 균주 PAO1(계통군 1), PA14(계통군 2) 및 PA7(계통군 3)과 함께 여기에 예시된 바와 같이 특정 균주에 의해 생성된 mRL 및 dRL의 대략적인 농도를 추정하는 데 사용할 수 있습니다.

서문

녹농균(Pseudomonas aeruginosa)은 환경 박테리아이며 독성 관련 형질의 생성과 높은 항생제 내성으로 인해 큰 우려가 있는 기회 감염 병원체입니다 ^1,2. 이 박테리아에 의해 생성되는 특징적인 2차 대사 산물은 생물 계면활성제 RL이며, 이는 산화 환원 활성을 가진 항생제인 페나진 피오시아닌(phenazine pyocyanin) 및 프로테아제 엘라스타제³와 같은 여러 독성 관련 특성과 조화롭게 생산됩니다. RL의 텐시오 활성 및 유화 특성은 다양한 산업 응용 분야에서 활용되었으며 현재 상용화되어 있습니다⁴.

계통군 1 및 2에 속하는 대부분의 녹농균 균주는 두 가지 유형의 RL을 생성한다: 주로 10개의 탄소로 구성된 지방산 이량체에 연결된 하나의 람노스 부분으로 구성된 mRL과 첫 번째 람노스⁴에 연결된 추가적인 람노스 부분을 포함하는 dRL. 그러나 두 개의 작은 ....

프로토콜

이 절차는 보충 그림 1에 도식화되어 있습니다. 연구에 사용된 시약 및 장비는 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. TLC를 사용한 녹농균(P. aeruginosa)의 배양 상층액에서 mRL 및 dRL 검출

1. 관심 있는 P. aeruginosa 균주의 원심 분리된 육수로 시작하여 액체 배지에서 24시간 동안 배양합니다(RL이 생성되는 고정 성장 단계에 도달하기 위해). 일반적으로 이러한 배양물에는 mL당 1 x 10⁹ 개의 박테리아가 포함되어 있습니다.
2. 농축된 HCl을 사용하여 배양액의 pH를 2로 조정합니다.
3. 50mL 폴리프로필렌 튜브에 산성화된 배양 상층액 5mL를 넣고 5mL의 2:1 클로로포름: 메탄올 혼합물을 추가합니다.
4. 매번 10초 동안 뒤집어서 튜브를 세 번 교반하고 각 교반 사이에 2분 동안 튜브를 반전 없이 그대로 둡니다.
5. 두 상이 분리될 때까지 약 3시간 동안 튜브를 교반하지 않고 그대로 두거나 4°C에서 3,000 x g ....

토론

RL을 검출하고 정량화하는 가장 정확한 방법은 질량 분석법(^MS)7,8,27과 결합된 HPLC입니다. 그러나 많은 연구자가 접근하기 어려울 수 있는 전문적이고 값비싼 장비가 필요합니다. 여기에 설명된 방법은 RL 농도를 검출하고 추정하기 위해 기본 실험실 재료 및 장비를 사용하여 일상적으로 수행할 수 있지만, 몇 가지 제한 사항, 특?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-NAPHTHOL	SIGMA-ALDRICH	70442
ACETIC ACID	J.T. BAKER	9508-02
CENTRIFUGE			For centrifuging tubes 1.5 mL and  50 mL
CHLOROFORM	J.T. BAKER	9180-02
DRYING OVEN
ETHER	J.T. BAKER	9244-02
GLASS PIPETTE	SIGMA-ALDRICH	CLS706510
HYDROCHLORIC ACID	J.T. BAKER	5622-02
LB
L-RHAMNOSE MONOHYDRATE	SIGMA-ALDRICH	R-3875
METHANOL	J.T. BAKER	9049-02
ORCINOL MONOHYDRATE	SIGMA-ALDRICH	O1875
PPGAS Broth			Tris HCL (0.12M), Potassium Chloride ( 0.02M) Ammonium Chloride (0.02M),  Peptone (1%), pH 7.4   Autoclaved. Add  Glucose (5%) and Magnesium Sulfate (0.0016M)
QUARTZ CELL (CUVETTE)	SIGMA-ALDRICH	Z276669
RECTANGULAR TLC DEVELOPING TANK	FISHER SCIENTIFIC	K4161801020
RHAMNOLIPIDS	SIGMA-ALDRICH	R-90
SPECTROPHOTOMETER			VIS
SPRAYER	SIGMA-ALDRICH	Z529710-1EA
SULFURIC ACID	J.T. BAKER	9681-02
TES TUBES 5mL	CORNING	352002
TLC SILICA GEL 60 F254	MERCK	1.05554.0001
WATER BATH			> 80 °C