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기사 소개

  • 요약
  • 초록
  • 서문
  • 프로토콜
  • 대표적 결과
  • 토론
  • 공개
  • 감사의 말
  • 자료
  • 참고문헌
  • 재인쇄 및 허가

요약

여기에서는 single-cell 및 single-nucleus RNA sequencing을 사용하여 인간 뇌 오가노이드의 생성 및 다운스트림 분석을 위한 포괄적인 프로토콜을 소개합니다.

초록

지난 10년 동안 단세포 전사체학은 크게 발전하여 개별 세포의 유전자 발현 프로파일을 동시에 분석하기 위한 표준 실험실 방법이 되어 세포 다양성을 포착할 수 있게 되었습니다. 분리하기 어려운 세포 유형으로 인한 한계를 극복하기 위해 온전한 세포 대신 단일 핵을 회수하는 것을 목표로 하는 대체 접근 방식을 염기서열 분석에 활용하여 개별 세포의 전사체 프로파일링을 보편적으로 적용할 수 있습니다. 이러한 기술은 뇌 오가노이드 연구의 초석이 되었으며, 발달 중인 인간 뇌의 모델로 자리 잡았습니다. 뇌 오가노이드 연구에서 단세포 및 단핵 전사체학의 잠재력을 활용하는 이 프로토콜은 오가노이드 해리, 단세포 또는 핵 분리, 라이브러리 준비 및 염기서열분석과 같은 주요 절차를 포괄하는 단계별 가이드를 제공합니다. 이러한 대체 접근법을 구현함으로써 연구자들은 고품질 데이터 세트를 얻을 수 있으며, 이를 통해 신경 세포 및 비신경 세포 유형, 유전자 발현 프로필 및 세포 계통 궤적을 식별할 수 있습니다. 이를 통해 뇌 발달을 형성하는 세포 과정과 분자 메커니즘에 대한 포괄적인 연구를 용이하게 할 수 있습니다.

서문

지난 몇 년 동안 오가노이드 기술은 장기 유사 조직 1,2,3을 배양하는 유망한 도구로 부상했습니다. 특히 인간의 뇌와 같이 쉽게 접근할 수 없는 장기의 경우, 오가노이드는 발병 및 질병 발현에 대한 통찰력을 얻을 수 있는 기회를 제공합니다4. 따라서 뇌 오가노이드는 발달, 정신 질환 또는 신경 퇴행성 질환을 포함한 다양한 인간 뇌 질환을 조사하기 위한 실험 모델로 널리 사용되어 왔습니다 4,5,6.

단세포 전사체 프로파일링 기술의 출현으로 1차 인체 조직 및 복잡한 in vitro 모델을 전례 없는 수준의 세밀성으로 연구할 수 있게 되었으며, 건강 및 질병의 세포 하위 집단 수준에서 유전자 발현 변화에 대한 기계론적 통찰력을 제공하고 새로운 추정 치료 표적에 대한 정보를 제공할 수 있었습니다....

프로토콜

설명된 프로토콜은 Max Delbrück Center for Molecular Medicine(승인 번호: 138/08)의 생물안전 레벨 1 실험실에서 요구 사항에 따라 연구 윤리에 대한 EU 및 국가 규칙에 따라 수행됩니다.

1. 유도만능줄기세포(iPSC)에서 전뇌 오가노이드 유도

참고: 이 프로토콜은 여러 회사의 다양한 줄기 세포 배지에서 배양된 여러 iPSC 라인에 대해 테스트되었습니다(표 1). 전뇌 오가노이드의 생성은 프로토콜 시작 전에 고품질 iPSC와 60%-70%의 합류점에 크게 의존합니다. 여기서는 시판되는 세포주를 사용했습니다( 재료 표 참조).

  1. 0일차: 배아체 형성
    1. 플루로닉 용액으로 96웰 플레이트를 처리하려면 96웰 U-바닥 플레이트의 웰당 80μL의 멸균 여과된 2% 플루로닉 용액을 추가합니다. 실온(RT) 또는 37°C에서 최소 15분 동안 배양합니다.
      알림: 플루로닉 처리된 플레이트는 4°C에서 최대 2주 동안 보관할 수 있으며 배아체 형성을 위한 세척 단계 없이 직접 사용할 수 있습니다.
    2. 세포를 파종하기 전에 흡입기 또는....

대표적 결과

scRNA-seq 및 snRNA-seq를 사용하여 뇌 오가노이드의 세포 유형 구성을 조사하기 위해 이 단계의 오가노이드는 이미 중간 전구세포와 초기 단계 뉴런으로 둘러싸인 전구세포로 구성된 신경상피 루프를 나타내기 때문에 배양 30일 후 뇌 오가노이드를 수확했습니다 4,18. 성장 및 배양 전반에 걸쳐 오가노이드의 품질을 모니터링하는 것은 신뢰할 수 있는 단세포.......

토론

단일 세포 및 단일 핵의 전사체 분석은 복잡한 조직 내의 유전자 조절 메커니즘을 이해하기 위한 중추적인 도구로 부상했습니다. 두 방법 모두 뇌 오가노이드의 전사체 연구를 가능하게 합니다. 전반적으로 성공적인 실험을 보장하기 위해서는 출발 물질의 품질이 높은 관련성을 가져야 합니다. 따라서, 괴사성 코어(necrotic core)(26)의 형성을 방지하기 위해 오가노이드를 정기적으?.......

공개

저자는 경쟁하는 재정적 이익이 없음을 선언합니다.

감사의 말

Miltenyi 신경 해리 키트에 대한 원본 지침에 대해 Valeria Fernandez-Vallone에게 감사드립니다. 또한 NP40 용해 완충액에 대한 레시피와 이 프로토콜을 설정하는 데 귀중한 조언을 제공한 Max Delbrueck Centrum의 유전체학 기술 플랫폼에도 감사드립니다. 또한 실험실 조직의 지원을 아끼지 않은 Margareta Herzog와 Alexandra Tschernycheff에게도 감사의 뜻을 전합니다.

....

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
1,4-DITHIO-DL-THREIT-LSG., F. D. MOL.-BIOL., ~1 M IN H2O (DTT)Sigma 43816-10ML
1.5 ml DNA low binding tubes VWR525-0130microcentrifuge tube
10x Cellranger pipeline analysis pipline
15 ml FalconFalconCentrifuge tube
2-Mercaptoethanol (BME)Life Technologies21985023
50 ml FalconFalconCentrifuge tube
A83-01Bio Technologies379762
Antibiotic/Antimycotic Solution (100X)Life Technologies15240062
B-27 Plus SupplementLife Technologies17504044
B-27 Supplement without vitamin ALife Technologies12587010
Bovine serum albumin, fatty acid free (BSA)Sigma AldrichA8806-5G 
cAMPBiogems6099240
cAMPBiogems6099240
C-CHIP NEUBAUER IMPROVEDVWRDHC-N01
Cell strainer 40 µmNeolab352340
Cell strainer 70 µm (white) NylonSigmaCLS431751-50EA
Chromium Controller & Next GEM Accessory Kit10X Genomics1000204
Chromium Next GEM Chip G Single Cell Kit, 16 rxns10X Genomics1000127
Chromium Next GEM Single Cell 3' Kit v3.110X Genomics1000268
Complete,  EDTA-free Protease Inhibitor CocktaillRoche11873580001
DAPIMERCK Chemicals0000001722
DMEM/F12Life Technologies11320074
Dounce tissue grinder set 2 mL completeSigma Aldrich10536355
Essential E8 Flex MediumLife TechnologiesA2858501
EVE Cell Counting SlidesVWREVS-050 ( 734-2676)
Foetal bovine serum tetracycline free (FBS)PAN BiotechP30-3602
Geltrex LDEV-Free (coating)Life TechnologiesA1413302 
gentleMACSMiltenyi Biotecdissociation maschine
GlutaMAX supplementsLife Technologies35050038
Heparin sodium cell culture testedSigmaH3149-10KU
human recombinant BDNFStemCell Technologies78005.3
human recombinant GDNFStemCell Technologies78058.3
Insulin Solution HumanSigma AldrichI2643-25MG
Knockout serum replacementLife Technologies10828028
LDN193189 Hydrochloride 98%Sigma Aldrich130-106-540
MEM non-essential amino acid (100x)Sigma AldrichM7145-100ml
MgCl2 Magnesium Chloride (1M) RNAse freeThermo ScientificAM9530G
mTeSR PlusStemCell Technologies100-0276stem cell medium
mTeSR1StemCell Technologies85850stem cell medium
N2 Supplement StemCell Technologies17502048
Neural Tissue Dissociation KitMiltenyi Biotec B.V. & Co. KG130-092-628
Neurobasal PlusLife TechnologiesA3582901
NextSeq500 systemIlluminaSequencer
NP-40 Surfact-Amps Detergent SolutionLife Technologies28324
PBS Dulbecco’sInvitrogen14190169
PenStrep (Penicillin - Streptomycin)Life Technologies15140122
PercollTh. Geyer10668276
Pluronic (R) F-127Sigma AldrichP2443-1KG
RiboLock RNase InhibitorLife Technologies EO0382
Rock Inhibitor (Y-27632 dihydrochloride) SBBiomolCay10005583-10
SB 431542 Biogems3014193
Sodium chloride NaCl (5M), RNase-free-100 mLInvitrogenAM9760G
StemFlex MediumThermo ScientificA3349401stem cell medium
StemMACS iPS-Brew XFMiltenyi Biotec130-104-368stem cell medium
TC-Platte 96 Well, round bottomSarstedt83.3925.500
TISSUi006-ATissUse GmbHhttps://hpscreg.eu/cell-line/TISSUi006-A
Trypan BlueT8154-20mlSigma
TrypLE Express Enzyme, no phenol redLife Technologies12604013Trypsin-based reagent
UltraPure 1M Tris-HCl Buffer, pH 7.5Life Technologies15567027
XAV939Enzo Life sciencesBML-WN100-0005

참고문헌

  1. Finkbeiner, S. R., et al. Stem cell-derived human intestinal organoids as an infection model for Rotaviruses. mBio. 3 (4), e00159-e00212 (2012).
  2. Freedman, B. S., et al.

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