계란 기생충의 RNA 간섭, Trichogramma dendrolimi Matsumura

요약

RNA 간섭(RNAi)의 조작은 Trichogramma 말벌과 같이 크기가 작은 많은 기생충 종에서 만만치 않은 도전을 제시합니다. 이 연구는 Trichogramma denrolimi에서 효율적인 RNAi 방법을 설명했습니다. 본 방법론은 Trichogramma 말벌의 유전자 조절을 조사하기 위한 강력한 모델을 제공합니다.

초록

알 기생충인 Trichogramma spp는 농업과 산림에서 다양한 나비목 해충에 대한 효율적인 생물학적 방제제로 인정받고 있습니다. Trichogramma 자손의 미성숙 단계는 숙주 난자 내에서 발달하여 현저한 작음(성인 길이 약 0.5mm)을 나타냅니다. RNA 간섭(RNAi) 방법론은 수많은 유기체의 유전자 기능을 규명하기 위한 중요한 도구로 부상했습니다. 그러나 Trichogramma와 같은 특정 작은 기생충 종에서 RNAi를 조작하는 것은 일반적으로 상당한 도전을 제기했습니다. 이 연구에서는 Trichogramma denrolimi에서 효율적인 RNAi 방법을 제시합니다. 간략하게 설명된 절차에는 숙주 난자에서 개별 T. dendrolimi 검체의 획득 및 분리, 이중 가닥 RNA(dsRNA)의 설계 및 합성, T. dendrolimi 번데기의 체외 이식 및 배양, dsRNA의 미세 주입 및 RT-qPCR 분석을 통한 표적 유전자 녹다운의 후속 평가가 포함됩니다. 이 연구는 T. dendrolimi에서 RNAi 실험을 수행하기 위한 포괄적이고 시각적으로 상세한 절차를 제공하여 연구원이 이 종의 유전자 조절을 조사할 수 있도록 합니다. 또한 이 방법론은 약간의 조정으로 다른 Trichogramma 종의 RNAi 연구 또는 미세 주입에 적용할 수 있으므로 다른 기생충 종에서 RNAi 실험을 수행하는 데 귀중한 참고 자료가 됩니다.

서문

Trichogramma spp.는 전 세계 농업 및 산림 생태계에서 광범위한 나비목 해충에 대한 고효율 생물학적 방제제로 광범위하게 활용된 계란 기생충 그룹입니다 1,2,3,4. 대량 사육 Trichogramma의 적용은 해충의 지속 가능한 관리를위한 환경 친화적 인 접근 방식을 제공합니다 ^5,6,7. Trichogramma 말벌의 분자 생물학을 이해하면 유전자 조절 및 게놈 편집 방법론을 조사하여 이러한 생물학적 방제제 ^8,9의 대량 사육 효율성과 현장 성능을 향상시키는 데 귀중한 통찰력을 제공합니다¹⁰.

1998년 예쁜꼬마선충(Caenorhabditis elegans)에서 이중 가닥 RNA(dsRNA) 매개 특이적 유전적 간섭이 발견된 이후, RNA 간섭(RNAi) 방법은 표적 유전자의 발현을 억제하여 유기체의 조절 메커니즘을 탐구하기 위한 중요한 유전 툴킷으로 발전했습니다¹¹. RNAi 실험은 수많은 곤충 종의 유전자 기능을 연구하는 데 널리 적용되는 표준 방법론이 되었습니다^12,13. 그럼에도 불구하고, RNAi의 조작은 많은 기생충 종들, 특히 내생충 Chalcidoidea 과에 속하는 종들 사이에서 만만치 않은 도전을 제시한다 14,15,16. RNAi 방법은 적어도 13개의 기생충 종 14,15,16,17,18,19에서 문서화되었습니다. 이 중 RNAi 접근법은 Nasonia 말벌에서 포괄적으로 수행되었으며 배아, 유충, 번데기 및 성충을 포함한 발달 단계 전반에 걸쳐 적용할 수 있습니다 14,15,16. Nasonia 말벌은 외부 기생충으로, 숙주 번데기와 번데기 사이의 틈새 공간에서 자손이 발달하여 시험관 내에서 배양할 수 있고 미세 주입과 같은 특정 치료를 견딜 수 있습니다. Nasonia 말벌과 달리 Trichogramma 개체는 숙주 알 내에서 전체 배아, 유충 및 번데기 발달을 겪습니다. 배아 및 유충 단계의 층(dsRNA 투과성을 저해할 수 있음), 손상에 대한 취약성 및 체외 생존의 어려움은 만만치 않은 장애물을 제시합니다 20,21,22. 또한, Trichogramma 개체의 작은 크기는 성인 또는 번데기 길이에서 약 ~ 0.5mm로^20,21,22를 조작하기에 매우 복잡합니다.

본 연구에서는 Trichogramma denrolimi Matsumura에서 RNA 간섭(RNAi) 실험을 수행하기 위한 포괄적인 절차를 간략하게 설명합니다. 이 절차에는 (1) 이중 가닥 RNA(dsRNA)의 설계 및 합성, (2) T. denrolimi 번데기의 미세 주입, (3) 번데기의 이식 및 체외 배양, (4) RT-qPCR 분석을 통한 표적 유전자 녹다운 검출이 포함됩니다. RNAi 실험을 위해 선택된 표적 유전자는 페리틴 중쇄 상동성(ferhch)이다. 철 결합 단백질인 FerHCH는 항산화 기능이 부여된 페록시다아제 센터를 함유하여 Fe²⁺에서 Fe³⁺로의 산화를 촉진합니다. 산화 환원 평형과 철 항상성을 유지하여 다양한 유기체의 성장과 발달에 없어서는 안될 역할을합니다. FerHCH의 고갈은 철분의 과잉 축적을 초래하여 돌이킬 수 없는 조직 손상을 초래할 수 있으며, 종종 성장 결함, 기형 및 사망률을 포함한 중요한 표현형 변화를 초래할 수 있습니다^23,24. 이 연구는 T. denrolimi에서 RNAi를 수행하기 위한 단계별 가이드를 제공하며, 이는 Trichogramma 말벌의 더 넓은 맥락에서 유전자 기능을 조사하는 데 매우 유용할 것입니다.

프로토콜

알림: 이 프로토콜에 사용된 모든 재료, 기기, 소프트웨어 및 시약과 관련된 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.

1. 곤충 배양의 수집 및 유지

1. 아라비아 고무 분말과 물 5,000 : 9의 1 : 5 (v / v) 용액을 사용하여 Corcyra cephalonica (Stainton)의 ~ 16 개 알을^25,26cm 카드에 부착합니다.
   알림: 과밀로 인해 후속 이송 및 해부 절차가 불가능하므로 카드에 너무 많은 숙주 알을 부착하지 마십시오.
2. 숙주 알의 부화를 방지하려면 숙주 알 카드를 30분 동안 자외선(UV) 조사에 노출시킵니다(그림 1-i). 그런 다음 비활성화 계란이 있는 종이를 두께 1cm, 직경 8cm의 계란 카드로 자르고 각각 약 300-500개의 계란을 포함합니다(그림 1-ii)25,26,27.
3. 직경 2cm, 길이 8cm의 유리관에 80-120 T. denrolimi 말벌 집단을 도입합니다. 면으로 튜브를 밀봉하십시오.
   알림: 말벌을 25 ± 1 °C의 온도로 유지하고 16 시간의 빛과 8 시간의 어둠의 밝음/어두움주기로 약 75 %의 상대 습도를 유지하십시오.
4. 기생을 위해 말벌에게 숙주 알 카드를 제시합니다(그림 1-ii). 말벌이 6시간 동안 숙주 알에 알을 낳도록 한 후 즉시 말벌을 제거하십시오.
   참고 : 기생 기간을 과도하게 연장하면 숙주 알 내에서 T. denrolimi 자손이 과밀화되어 자손 말벌 사망률이 증가 할 수 있으므로 피하십시오^28,29.

2. dsRNA의 합성

1. 이중 가닥 RNA(dsRNA) 합성을 위한 T7 promoter를 포함하는 프라이머 세트를 설계합니다. dsRNA 합성을 위해 표적 유전자(Ferhch)에서 300-400bp 세그먼트를 선택합니다.
2. 표적 유전자에 대한 dsRNA 및 음성 대조군으로 사용하기 위한 dsGFP 생산을 위해 상업적으로 합성된 프라이머 세트를 획득합니다.
3. 제조업체의 프로토콜⁹에 따라 참조된 키트를 사용하여 100마리의 T. denrolimi 말벌에서 RNA 함량을 추출합니다. RNA 함량의 품질을 확인하십시오. OD260/OD280 값의 범위가 1.8에서 2.0^{사이인 경우 진행합니다 9}.
4. 2 μL의 5x 완충액(1 U/50 μL), 1 μL의 DNAse(1 U/50 μL) 및 6.5 μL의 RNA(~100 ng/μL), 0.5 μL의 H₂O로 42°C에서 2분 동안 RNA 함량을 정제합니다.
5. 역전사 효소 중합효소 연쇄 반응(RT-PCR)을 수행하여 10μL의 정제된 RNA(~100ng/μL), 4μL의 5x 완충액(1U/50μL), 1μL의 효소 믹스 I(1U/50μL) 및 4μL의 H_2O로 cDNA 템플릿을 생성합니다. 다음 설정을 사용하여 RT-PCR을 수행합니다. 37 °C에서 15 분, 85초 동안 5°C. 사용할 때까지 cDNA 산물을 -4 °C에서 보관하십시오.
6. 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하여 참조된 마스터 믹스(Taq II 10μL[1U/50μL], 0.8μL의 순방향 프라이머[0.4μM], 0.8μL의 역방향 프라이머[0.4μM], 0.8μL의 DNA 템플릿[40ng/μL], 7.6μL의 H_2O)에 따라 dsRNA 염기서열을 증폭합니다. 다음 설정을 사용하여 PCR을 수행합니다: 94분 동안 2°C; 30초 동안 94°C, 30초 동안 60°C, 30초 동안 72°C에서 35회 주기; 72°C에서 2분 동안
7. 2.0% 아가로스 겔 ^5,9에 대한 전기영동으로 PCR 산물의 품질을 평가하고 Sanger 염기서열분석을 통해 표적 염기서열을 확인합니다.
8. 제조업체의 지침 ^9,23에 따라 겔 추출 키트를 사용하여 PCR 산물을 정제합니다.
9. RNAi 시스템을 활용하여 30분 동안 37°C, 10분 동안 70°C, 20분 동안 25°C의 2x 완충액(0.02U/μL), 8μL의 DNA 템플릿(75ng/μL) 및 2μL의 효소 혼합물(1U/50μL)로 표적 유전자에 대한 dsRNA를 합성합니다. 합성된 dsRNA를 30μL의 뉴클레아제가 없는 물로 용리합니다.
10. dsRNA 산물을 1.0% 아가로스 겔 ^5,9에서 시각화하여 품질을 평가합니다. dsRNA를 7,000ng/μL로 희석합니다. dsRNA 제품의 품질을 확인합니다. OD260/OD280 값의 범위가 1.8에서 2.0^{사이인 경우 진행합니다 9}. dsRNA 제품을 사용할 때까지 -20 °C에서 보관하십시오.

3. T. denrolimi 번데기의 이식

1. 기생한 숙주 알을 25 ± 1°C에서 약 8일 동안 배양하고 16시간 빛/8시간 어두운 주기와 ~75%의 상대 습도를 유지합니다. 기생한 숙주 알은 5일³⁰일 후에 검게 변합니다(그림 1-iv,v).
2. 숙주 계란 카드를 해부 현미경으로 옮깁니다. 한 쌍의 텅스텐 바늘(그림 1-vi)을 사용하여 숙주 알(그림 1-vii)에서 융모막을 꼼꼼하게 제거하고 내부에서 번데기를 회수합니다(그림 1-viii)^5,17,18.
   알림: 해부 바늘의 끝은 0.05mm 미만이어야 합니다.
3. 기판을 위한 깨끗한 판을 준비합니다. 15g/L 한천 용액 10-15mL를 부어 자연 냉각시킵니다(그림 2-i).
   참고: 한천 용액을 0.5g의 스트렙토마이신과 혼합하여 시험관 내 오염 물질의 성장을 억제합니다.
4. 소독된 조각기를 사용하여 깊이 0.2-0.3mm, 너비 0.4-0.8mm의 여러 홈을 에칭합니다(그림 2-ii).
5. 작은 브러시(그림 2-iii)를 사용하여 절개된 숙주 알의 번데기를 한천 기질의 홈 중 하나에 이식합니다(그림 2-iv).
6. 3.4단계와 3.5단계를 반복하여 100-300마리의 번데기를 홈에 하나씩 이식합니다(그림 2-v).

4. dsRNA를 T. denrolimi 번데기에 미세 주입

1. 유리 바늘 풀러를 사용하여 유리 모세관을 당깁니다(그림 3-i,ii). 니들 풀러에서 Heat를 280으로, Velocity를 170으로, Delay를 250으로, Pull을 30으로 설정합니다(그림 3-iii). 미세 주입을 위해 여러 개의 모세관 유리 바늘을 준비합니다(그림 3-iv,v).
2. 연마판을 사용하여 유리 바늘 끝을 경사지게 합니다(그림 3-vi).
   알림: 주사 바늘의 끝이 날카롭게 유지되는지 확인하십시오. 그렇지 않으면 번데기 폐사를 초래하거나 바늘을 통한 시약 흐름을 방해할 수 있습니다(그림 3-vii).
3. 마이크로 주입 펌프를 사용하여 약 2μL의 dsRNA 주입 용액에 7,000ng/μL를 주입하여 준비된 주사 바늘에 넣습니다(그림 3-vii).
4. 수백 개의 번데기가 들어 있는 한천 기질을 복합 현미경의 플랫폼으로 옮깁니다(그림 3-viii).
5. 주사 바늘을 T. denrolimi 번데기의 복부에 렌즈 아래 복부에 ~30° 각도로 조심스럽게 삽입합니다(그림 3-ix).
6. 주사액(단계 4.3)의 ~5nL를 T. denrolimi 번데기에 가능한 한 부드럽게 점차적으로 주입합니다.
   참고: T. denrolimi 번데기는 dsRNA 용액을 주입할 때 약간 부풀어 오를 수 있습니다. 번데기에 과도한 양의 용액을 주입하거나 지나치게 큰 구멍이 있는 바늘을 사용하면 번데기가 조기에 사망할 수 있습니다. 번데기를 여러 마리에서 수십 마리 정도 주사한 후 바늘이 막히면 바늘을 교체합니다.
7. 4.5단계와 4.6단계를 반복하여 dsRNA를 번데기 600마리에 하나씩 주입합니다.
   참고: 신뢰할 수 있는 RT-qPCR 분석을 위해서는 최소 100개의 번데기에서 RNA 함량을 분리해야 합니다. dsRNA 처리에서 3회 복제에 대해 최소 600개의 번데기를 주입하고 dsGFP 음성 대조군⁹에서 3회 복제합니다.

5. T. denrolimi 번데기의 배양

1. 주입된 번데기가 포함된 기질을 25 ± 1°C의 인큐베이터로 16시간/8시간 명암주기 및 ~75% RH로 옮깁니다.
2. 치료당 약 700마리의 T. denrolimi 번데기를 24시간 또는 48시간 동안 배양합니다. 복제당 100마리의 번데기 그룹에서 RNA 함량을 추출합니다⁹.
   알림: 샘플에서 수축된 번데기(죽은 번데기)를 제거합니다. 그렇지 않으면 유전자 발현 검출에 오류가 발생할 수 있습니다.
3. 말벌이 나올 때까지 치료당 ~50마리의 T. denrolimi 번데기를 배양합니다(그림 3-x). 출현율과 변형률을 기록합니다.

6. 표적 유전자 발현 검출

1. design tool을 사용하여 RT-qPCR의 표적 유전자 및 참조 유전자에 대한 primer set을 설계합니다.
   참고: RT-qPCR 프라이머의 염기서열이 dsRNA의 표적 영역과 겹치지 않는지 확인하십시오.
2. 유전자 포크헤드 박스 O (FoxO)를 RT-qPCR 분석에서 참조 유전자로 사용합니다. FoxO 의 뇌관은 이전에^{보고된 바 있다 9}.
3. 상업적으로 합성된 프라이머 세트를 얻습니다. 10 μL의 Taq II(1 U/50 μL), 0.8 μL의 순방향 프라이머(0.4 μM), 0.8 μL의 역방향 프라이머(0.4 μM), 0.8 μL의 주형(10 ng/μL) 및 7.6 μL의 H₂O로 RT-qPCR을 수행합니다. 다음 설정을 사용하여 RT-qPCR을 수행합니다: 30초 동안 95°C; 5초 동안 95°C, 30초 동안 57°C, 30초 동안 72°C에서 35사이클; 10초 동안 95°C; 60초 동안 5°C, 95초 동안 5°C.
4. ^2-ΔΔCt 방법 ^9,25를 사용하여 표적 유전자의 발현 값을 계산합니다.
5. Kruskal-Wallis 테스트를 사용하여 다양한 처리(dsFerhch, dsGFP, 비주사)의 영향을 받는 표적 유전자의 발현을 분석합니다.
   참고: 데이터의 이분산성과 비정규성으로 인해 잘못된 결론이 나올 수 있으므로 사후 비교를 위해 모수적 검정(예: t-검정)을 사용하지 마십시오²⁵.

결과

dsFerhch를 주입한 번데기(T. denrolimi 번데기)의 출현율은 dsGFP를 주입한 번데기 또는 주입하지 않은 번데기의 출현률보다 현저히 낮았다(표 1). 출현한 말벌 중 dsFerhch를 투여받은 T. denrolimi 말벌의 51.85%가 변형된 작은 날개를 발달시켰다. 변형된 말벌은 dsGFP를 주입하거나 주입하지 않은 말벌에서 관찰되지 않았다(표 1). 또한, dsFerhch<...

토론

Trichogramma 말벌은 특히 농업 및 임업에서 다양한 나비목 해충을 표적으로 하는 효과적인 생물학적 방제제로 인식되고^{있습니다 1}. 이 작은 말벌은 숙주 알 내에서 미성숙 단계를 거치는데, 이는 RNAi 실험 ^5,18을 수행하는 데 어려움을 주는 특성입니다. 이 연구는 T. denrolimi에서 RNAi 실험을 수행하기 위한 포괄적인 시각적 가이...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
2x ES Taq MasterMix (Dye)	Cowin Biotech, China	CW0690H	To amplify the dsRNA sequences
20x PBS Buffer, DEPC treated (7.2-7.6)	Sangon Biotech, China	B540627-0500	To dilute dsRNA
Agar strip	Shishi Globe Agar Industries Co.,Ltd, China	n/a	To make culture medium
Ampicillin sodium	Sangon Biotech, China	A610028	To make culture medium
Bioer Constant temperature metal bath	BIOER, China	MB-102	To synthesis dsRNA
Borosilicate glass capillary	WPI, USA	1B100-4	To pull capillary glass needle
Clean bench	Airtech, China	SW-CJ-1FD	To extract RNA
Double distilled water	Sangon Biotech, China	A500197-0500	To dilute cDNA
Environmental Testing chamber	Panasonic, Japan	MLR-352H-PC	To culture T. denrolimi
Eppendorf Centrifuge	Eppendrof, Germany	5418R	To store RNA content
Eppendorf FemtoJet 4i	Eppendrof, Germany	FemtoJet 4i	To inject T. denrolimi
Eppendorf Refrigerated Centrifuge	Eppendrof, Germany	5810R	Centrifuge
Ethanol solution (75%, RNase-free)	Aladdin, China	M052131-500ml	To extract RNA
Gel Extraction Kit	Omega, USA	D25000-02	To extract cDNA
GUM Arabic	Solarbio, China	CG5991-500g	To make egg card
Isopropyl alchohol	Aladdin, China	80109218	To extract RNA
Laser-Based Micropipette Puller	SUTTER, USA	P-2000	To pull capillary glass needle
Microloader	Eppendrof, Germany	20 µL	To load dsRNA
Multi-sample tissue grinder	LICHEN, China	LC-TG-24	To grind T. denrolimi
Needle Grinder	SUTTER, USA	BV-10-E	To grind capillary glass needle
Nuclease-Free Water	Sangon Biotech, China		To dilute RNA
OLYMPUS Microscope	OLYMPUS, Japan	XZX16	To observe T. denrolimi
PCR machine	Bio-rad, USA	S-1000	For DNA amplification
PowerPac Basic	Bio-rad, USA	PowerPacTM Basic	To detect the quality of dsRNA
Primer of dsGFP (Forward)			[TAATACGACTCACTATAGGG] ACAAACCAAGGCAAGTAATA
Primer of dsGFP (Reverse)			[TAATACGACTCACTATAGGG] CAGAGGCATCTTCAACG
Primer of Ferhch for qPCR (Forward)			TGAAGAGATTCTGCGTTCTGCT
Primer of Ferhch for qPCR (Reverse)			CTGTAGGAACATCAGCAGGCTT
Primer of Ferhch for RNAi (Reverse)			[TAATACGACTCACTATAGGG]AG TAGCCATCATCTTTCC
Primer of Ferhch for RNAi(Forward)			[TAATACGACTCACTATAGGG] ACACTGTCAATCGTCCTG
Primer of FoxO for qPCR (Forward)			CTACGCCGATCTCATAACGC
Primer of FoxO for qPCR (Reverse)			TGCTGTCGCCCTTGTCCT
PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)	TaKaRa, Japan	RR047A
Quantitative Real-time PCR	Bio-rad, USA	CFX 96 Touch	To perform reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR)
Real-time PCR (TaqMan) Primer and Probes Design Tool			https://www.genscript.com/tools/real-time-pcr-taqman-primer-design-tool/
T7 RiBoMAX Express RNAi System	Promega, USA	P1700	To synthesis dsRNA  in vitro
TB Green Premix Ex TaqTM (Til RnaseH Plus)	TaKaRa, Japan	RR820A	To perform RT-qPCR
Trichloromethane	KESHI, China	GB/T682-2002	To extract RNA
TRIzol Reagent	Ambion, USA	15596018	To extract total RNA content from samples
Ultra-low Temperature Freezer	Thermo, USA	Forma 911