Cell-Free Expression System의 캡슐화에 의한 박테리아 글루타메이트 수용체 채널의 재구성

요약

이 프로토콜은 모델 막 단백질을 지질 이중층으로 합성하고 통합하는 연구를 위해 거대 단층 소포(GUV) 내에 CFE(cell-free expression) 시스템을 캡슐화하는 데 사용되는 역에멀젼 방법을 설명합니다.

초록

CFE(Cell-Free Expression) 시스템은 합성 세포의 생체 감지 및 에너지 재생과 같은 세포 기능의 생체 모방을 가능하게 하는 합성 생물학의 강력한 도구입니다. 그러나 광범위한 세포 과정을 재구성하려면 막 단백질을 합성 세포의 막으로 성공적으로 재구성해야 합니다. 용해성 단백질의 발현은 일반적으로 일반적인 CFE 시스템에서 성공적이지만, 합성 세포의 지질 이중층에서 막 단백질을 재구성하는 것은 어려운 것으로 입증되었습니다. 여기에서는 합성 세포 내부의 CFE 반응의 캡슐화 및 배양을 기반으로 모델 합성 세포로서 거대 단층 소포체(GUV)에서 모델 막 단백질인 박테리아 글루타메이트 수용체(GluR0)를 재구성하는 방법을 시연합니다. 이 플랫폼을 활용하여 GluR0의 N-말단 신호 펩타이드를 프로테오로돕신 신호 펩타이드로 치환하는 것이 GluR0를 하이브리드 GUV의 막으로의 성공적인 동시 번역 전위에 미치는 효과를 입증합니다. 이 방법은 합성 세포에서 다양한 막 단백질의 세포 없는 재구성을 허용하는 강력한 절차를 제공합니다.

서문

상향식 합성생물학은 지난 10년 동안 생명공학, 약물 전달 및 재생 의학 분야에서 수많은 잠재적 응용 분야가 있는 신흥 분야로 점점 더 많은 관심을 받고 있습니다 ^1,2. 특히 상향식 합성생물학의 초석으로서의 합성세포의 개발은 합성세포의 유망한 응용과 체외 생물물리학 연구를 용이하게 하는 세포와 같은 물리적, 생화학적 특성으로 인해 광범위한 과학계를 매료시켰습니다 3,4,5,6 . 합성 세포는 종종 다양한 생물학적 과정이 재현되는 세포 크기의 거대 단층 소포(GUV)에서 엔지니어링됩니다. 세포 세포골격^{재구성 (Reconstitution of} cell cytoskeleton) ^7,8, 광 의존 에너지 재생 (light-dependent energy regeneration^{) 9}, 세포 통신

프로토콜

이 연구에 사용된 시약 및 장비는 재료 표에 나와 있습니다.

1. 작은 단층 소포(SUV)가 있는 경우 벌크 CFE 반응

1. SUV 준비
   알림: 이 단계는 클로로포름 작업에 대한 안전 지침에 따라 흄 후드에서 수행해야 합니다.
   1. 클로로포름에 용해된 76μL의 25mg/mL POPC 원액을 전사하여 유리 바이알에 5mM 1-팔미토일-2-올레오일-글리세로-3-포스포콜린(POPC) SUV를 준비합니다.
   2. 유리 바이알을 부드럽게 회전시키면서 바이알에 아르곤을 부드럽게 불어넣어 바닥에 건조된 지질 막을 형성합니다. 다음으로, 과도한 클로로포름을 증발시키기 위해 캡을 느슨하게 조인 상태에서 유리 바이알을 데시케이터로 옮깁니다.
   3. 유리 바이알을 데시케이터에 1시간 동안 보관하십시오. 그런 다음 0.5mL의 초순수 탈이온수를 첨가하여 약 2분 동안 지질막과 와류를 용해시킵니다.
   4. 두 개의 필터 지지대를 탈이온수에 담그고 각 내부 멤브레인 지지대에 놓아 미니 압출 장치를 설정합니다. 그런 다음 100nm 폴리카보네이트 필터를 담그고 압출기 외부 케이싱과 리테이너 너트로 함께 고정되는 두 개의 내부 멤브레인 지지대 사....

토론

세포 신호 전달 또는 세포 여기와 같이 세포막을 통한 분자 또는 정보의 전달에 의존하는 거의 모든 세포 과정에는 막 단백질이 필요합니다. 따라서 막 단백질의 재구성은 다양한 응용 분야에 대한 다양한 합성 세포 설계를 구현하는 데 있어 주요 병목 현상이 되었습니다. 생체막에서 막 단백질의 전통적인 세제 매개 재구성에는 부드러운 팽창 또는 전기 형성과 같은 GUV 생성 방법이 필요합니다. ?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 nm polycarbonate filter	STERLITECH	1270193
96 Well Clear Bottom Plate	ThermoFisher Scientific	165305
BioTek Synergy H1M Hybrid Multi-Mode Reader	Agilent	11-120-533
Creatine phosphate	Millipore Sigma	10621714001
CSU-X1 Confocal Scanner Unit	Yokogawa	CSU-X1
Density gradient medium (Optiprep)	Millipore Sigma	D1556	Optional to switch with sucrose in inner solution
Filter supports	Avanti	610014
Fisherbrand microtubes (1.5 mL)	Fisher Scientific	05-408-129
Folinic acid calcium salt hydrate	Millipore Sigma	F7878
Glucose	Millipore Sigma	158968
HEPES	Millipore Sigma	H3375
iXon X3 camera	Andor	DU-897E-CS0
L-Glutamic acid potassium salt monohydrate	Millipore Sigma	G1501
Light mineral oil	Millipore Sigma	M5904
Magnesium acetate tetrahydrate	Millipore Sigma	M5661
Mini-extruder kit (including syringe holder and extruder stand)	Avanti	610020
Olympus IX81 Inverted Microscope	Olympus	IX21
Olympus PlanApo N 60x Oil Microscope Objective	Olympus	1-U2B933
PEO-b-PBD	Polymer Source	P41745-BdEO
pET28b-PRSP-GluR0-sfGFP plasmid DNA	Homemade	N/A
pET28b-sfGFP-sfCherry(1-10) plasmid DNA	Homemade	N/A
pET28b-WT-GluR0-sfGFP plasmid DNA	Homemade	N/A
POPC lipid in chloroform	Avanti	850457C
Potassium chloride	Millipore Sigma	P9541
PUREfrex 2.0	Cosmo Bio USA	GFK-PF201
Ribonucleotide Solution Set	New England BioLabs	N0450
RNase Inhibitor, Murine	New England BioLabs	M0314S
RTS Amino Acid Sampler	Biotechrabbit	BR1401801
Sodium chloride	Millipore Sigma	S9888
Spermidine	Millipore Sigma	S2626
Sucrose	Millipore Sigma	S0389
VAPRO Vapor Pressure Osmometer Model 5600	ELITechGroup	VAPRO 5600