다세포 스페로이드의 생산 및 다중 파라미터 Live Cell Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM)

요약

여기에서는 후속 다중 파라미터 라이브 셀 현미경을 수행하기 위한 다양한 다세포 스페로이드 형성 방법을 설명합니다. 형광 평생 이미징 현미경(FLIM), 세포 자가형광, 염색 염료 및 나노 입자를 사용하여 살아있는 3차원(3D) 암 및 줄기 세포 유래 스페로이드에서 세포 대사, 저산소증 및 세포 사멸을 분석하는 접근 방식을 시연합니다.

초록

다세포 종양 스페로이드는 종양 미세환경을 재현하고, 약물 요법을 테스트 및 최적화하고, 3D 컨텍스트에서 바이오 및 나노 센서를 사용하기 위해 널리 사용되는 3D 조직 미세응집 모델입니다. 생산 용이성, 예측 가능한 크기, 성장, 관찰된 영양소 및 대사 산물 구배는 3D 틈새와 같은 세포 미세환경을 요약하는 데 중요합니다. 그러나 스페로이드 이질성과 생산 방법의 가변성은 전반적인 세포 대사, 생존력 및 약물 반응에 영향을 미칠 수 있습니다. 이로 인해 크기, 가변성, 생체 제조 요구 사항, 줄기 세포 및 암세포 생물학에서 체외 3D 조직 모델로 사용하는 요구 사항을 고려할 때 가장 적합한 방법론을 선택하기가 어렵습니다. 특히, 스페로이드 생산은 광학 대사 이미징, 형광 수명 이미징 현미경(FLIM), 나노 센서를 사용한 스페로이드 저산소증 모니터링 또는 생존력과 같은 정량적 라이브 현미경과의 호환성에 영향을 미칠 수 있습니다. 여기에는 여러 가지 기존의 스페로이드 형성 프로토콜이 제시되어 실시간 광시야, 공초점 및 이광자 현미경과의 호환성을 강조합니다. 다양한 유형의 암 및 줄기세포 스페로이드를 사용하는 다중 자가형광 FLIM을 사용한 후속 이미징에서 분석 파이프라인에 대한 후속 이미징도 제시됩니다.

서문

다세포 스페로이드는 세포의 자체 응집에 의해 얻어지고 구형을 나타내는 3D 조직 모델 그룹을 나타냅니다. 체외에서 세포-세포 및 세포-매트릭스 상호 작용을 모방하고 다수의 암 및 줄기 세포 유래 구조 내에서 3D 컨텍스트를 재현하는 데 널리 사용됩니다. 세포 부착을 줄이고 응집을 촉진하기 위해 몇 가지 기술이 사용됩니다. 여기에는 표면 장력¹에 의존하는 행잉 드롭 방법이 포함됩니다. 초저 부착 플레이트, 마이크로 몰드 및 마이크로 웰과 같은 세포 부착 방지 방법 ^2,3; 음향 파동 기반 접근법⁴; 흐름 유도 응집 방법(스피너 플라스크, 생물 반응기 및 미세유체 장치)⁵; 자기 입자 보조 형성⁶ 및 응집 촉진 합성 및 ECM 기반 매트릭스 및 스캐폴드의 사용 ^7,8,9.

암 연구, 개발 및....

프로토콜

1. 다세포 스페로이드의 생성

1. 세포 배양
   참고: 세포 배양은 ATCC(American Type Culture Collection), Lonza, Sigma-Aldrich 또는 기타 공급업체에서 수집할 수 있습니다. ATCC는 선호하는 성장 배지, 하위 배양 절차, 생물 안전성 수준, 성장률 및 STR 프로필을 포함하여 필요한 모든 취급 정보를 제공합니다. 여기에서 인간 대장암 세포주 HCT116의 500개 세포/스페로이드가 10% FBS 및 1mM 피루브산 나트륨이 보충된 McCoy의 5A 매체(VWR, 392-0420)에 사용됩니다. 매일 모니터링되는 장기 실험의 경우 10mM HEPES, pH 7.2를 배지에 추가할 수 있습니다.
   1. 70%-90% 밀도에 도달하도록 세포 배양을 성장시킵니다.
   2. 예열된(37°C) 멸균 PBS(75cm² 플라스크당 25cm² 또는 10mL의 경우 5mL)로 세포를 헹굽니다.
   3. 0.05% 트립신 - 1mM EDTA 용액(25cm²의 경우 0.5mL 또는 75cm² 플라스크당 1mL)을 추가하고 5% CO₂, 95% 습도에서 37°C에서 5-10분 동안 배양하여 세포 분리에 도달합니다.<....

토론

다세포 스페로이드는 종양 및 줄기세포 틈새 미세환경, 약물 발견 및 생체 제조를 위한 '조직 구성 요소' 개발 연구에서 선택되는 방법이 되고 있습니다. 스페로이드의 이질적인 내부 구조, 영양소의 기울기 및 산소화는 상대적으로 간단하고 접근하기 쉬운 환경에서 생체 내 조직 및 종양의 이를 모방할 수 있습니다. 더 많은 방법론적 투명성^26,28 .......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% Trypsin-EDTA	Gibco	25300-054	Also available from Sigma
10 mL serological pipets	VWR	612-3700	Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies
12 well cell-culture plates, sterile	Greiner bio-one	665-180	Similar products are also available from Sarstedt, Corning and other companies.
12 Well Chamber slide, removable	Ibidi	81201	Also available from Grace Bio-Labs, ThermoFisher Scientific and others
15 mL centrifuge tubes	Nerbe plus	02-502-3001	Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies
3D Petri Dish micromolds	Microtissue	Z764000-6EA
6 well cell-culture plates, sterile	Greiner bio-one	657160	Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies
70% ethanol	ChemLab	CL02.0537.5000
Biofloat	Sarstedt	83.3925.400	Commercial available coated 96-well plate for spheroid formation
Calcein Green-AM	Tebubio	AS-89201	Apply in dilution 1:1000
CellSens Dimension software	Olympus	version 3
Collagen from human placenta, type IV	Sigma	C5533	For the preparation of 0.07 mg/mL Collagen and 0.03 mg/mL Poly-D-lysine coated microscopy dishes
Confocal FLIM Microscope	Leica Microsystems	N/A	Stellaris 8 Falcon inverted microscope with white-light laser, HyD X detectors, climate / T control chamber (OkoLab), 25x/0.95 W objective
D(+)-Glucose	Merck	8342	Prepare 1 M stock solution, 1:100 for preparation of imaging medium (final concentration 10 mM)
Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), phenol red-, glucose-, pyruvate- and glutamine-free	Sigma-Aldrich	D5030-10X1L	For preparation of imaging medium
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	10270-098	Also available from Sigma. Needs to be heat-inactivated before use.
HEPES (1M)	Gibco	15630-080	Dilution 1/100 for preparation of imaging medium (final concentration 10 mM)
Human colon cancer cells HCT116	ATCC
ImageJ	NIH	version 1.54f
Leica Application Suite X (LAS X)	Leica Microsystems	version 4.6.1.27508
L-glutamine	Gibco	25030	Also available from Sigma. Apply in dilution 1:100.
Lipidure-CM5206	Amsbio	AMS.52000034GB1G
McCoy's 5A, need addition of 1 mM Sodium Pyruvate and 10 mM HEPES	VWR	392-0420	Standard growth medium for HCT116 cells
micro-patterned 3D-printed PDMS stamps	N/A	N/A	Provided by the Centre for Microsystems Technology, Professor Dr. Jan Vanfleteren, Ghent University
NaCl	Chemlab	CL00.1429.100
Neubauer couting chamber	Fisher Scientific	15980396
O2 probes: MMIR1	N/A	N/A	Full characterization, validation and some applications can be found at: https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2023.12.11.571110 v1
PBS	Fisher scientific	Gibco18912014	Dissolve PBS tablet in 500 mL of distilled water.
Pen Strep :Penicillin (10,000 U/mL) / streptomycin (10,000 μg/mL) 100x solution	Gibco	15140-122	Also available from Sigma. Apply in dilution 1:100.
Poly-D-lysine	Sigma	P6407-5mg	For the preparation of 0.07 mg/mL Collagen and 0.03 mg/mL Poly-D-lysine coated microscopy dishes
Propidium Iodide	Sigma-Aldrich	25535-16-4	Cell death staining, use 1 µg/mL at 1h incubation
PVDF syringe filter 0.22 µm	Novolab	A35149	Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies
Sodium pyruvate (100 mM)	Gibco	11360-070	Dilution 1/100 for preparation of imaging medium (final concentration 1mM)
SphericalPlate 5D 24-well	Kugelmeiers	SP5D-24W
sterile petridish	Greiner bio-one	633181	Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies
Tissue culture flask (25 cm² )	VWR	734-2311	Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies
Tissue culture flask (75 cm²)	VWR	734-2313	Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies
U-bottom 96-well plate	VWR	10062-900	Similar products are also available from Sarstedt, Corning, Greiner Bio-one and other companies
Ultrapure Agarose	Invitrogen (Life Technologies)	16500-500	Other types of Agarose such as Agarose low melting point (A-9414, Sigma), Agarose for routine use (A-9539, Sigma)
Widefield fluorescence inverted microscope	Olympus	N/A	Inverted fluorescence microscope IX81, with motorised Z-axis control, CoolLED pE4000 (16 channels, 365-770 nm), ORCA-Flash4.0LT (Hamamatsu) cMOS camera, glass warming plate Okolab, CellSens Dimension v.3 software and air objectives 4x/0.13 UPlanFLN and 40x/0.6 LUCPlanFLN. (Optional, for high-resolution imaging) 60x/1.0 LUMPLFLN water