미세아교세포(Microglia)를 이용한 망막 오가노이드 조립

요약

미세아교세포는 망막에 존재하는 독특한 면역 세포로, 다양한 망막 퇴행성 질환에서 중요한 역할을 합니다. 미세아교세포와 망막 오가노이드의 공동 배양 모델을 생성하면 망막 질환의 발병 기전 및 발병 진행 상황을 더 잘 이해할 수 있습니다.

초록

인간 망막의 접근성이 제한적으로 인해 망막 오가노이드(RO)는 인간 망막 질환을 연구하는 데 가장 적합한 모델이며, 이를 통해 망막 발달 메커니즘과 망막 질환의 발생을 밝힐 수 있습니다. 미세아교세포(MG)는 망막과 중추신경계(CNS)에 있는 독특한 대식세포로, 중요한 면역 기능을 수행합니다. 그러나 망막 오가노이드는 분화 기원이 난황낭이기 때문에 미세아교세포가 없습니다. 이러한 망막 질환에서 미세아교세포의 구체적인 발병 기전은 불분명합니다. 따라서 미세아교세포에 통합된 망막 오가노이드 모델의 확립이 필요한 것으로 밝혀졌습니다. 여기에서 우리는 인간 줄기세포에서 유래한 미세아교세포와 망막 오가노이드의 공동 배양 모델을 성공적으로 구축했습니다. 이 기사에서는 미세아교세포를 분화한 후 초기 단계에서 망막 오가노이드와 공동 배양했습니다. 면역 세포의 통합으로서 이 모델은 망막 및 CNS 관련 질환의 발병 기전 및 치료에 대한 심층적인 연구를 용이하게 하기 위해 망막 질환 모델링 및 약물 스크리닝에 최적화된 플랫폼을 제공합니다.

서문

인간 망막의 제한된 소스로서 인간 줄기 세포를 3차원(3D) 망막 오가노이드로 분화하는 것은 망막¹을 시뮬레이션하기 위한 유망한 in vitro 모델을 나타냅니다. 망막에는 광수용체(photoreceptor), 망막 신경절 세포(retinal ganglion cell), 양극성 세포(bipolar cell), 뮐러 세포(Müller cell), 수평 세포(horizontal cells), 성상교세포(astrocyte) 등 다양한 세포 유형이 포함되어 있다². 이 모델은 망막 발달 메커니즘과 망막 질환의 발병 기전을 모방하고 연구할 수 있게 합니다. 그러나 방향성 분화 방법으로 인해 망막 오가노이드는 신경외배엽³에서 파생되었으며, 난황낭의 미세아교세포 및 중배엽 ^4,5,6의 혈관 주위 세포와 같이 다른 생식층에서 유래하는 다른 많은 세포 유형이 부족했습니다.

현재 색소성 망막염⁷, 녹내장

프로토콜

이 연구는 Capital Medical University의 Beijing Tongren Hospital의 기관 윤리 위원회의 승인을 받았습니다. HESCs 세포주 H9는 WiCell Research Institute에서 생산되었습니다. 실험 전에 세포 배양 배지를 실온(RT)에서 30분 동안 사전 예열합니다.

1. 인간 미세아교세포의 생성

1. 세포 밀도가 80%-90%에 도달할 때까지 줄기 세포 배지에서 hESC를 배양합니다. 각 웰에 최소 1 x 10⁶ 세포를 파종합니다.
2. 줄기 세포 배지를 흡입하고 1x DPBS(1mL/6웰 플레이트의 웰)로 세포를 헹굽니다. 다음 단계에는 2 x 10^7-1 x 10⁸ 셀이 필요합니다. 충분하지 않은 경우 2-5개의 웰 셀을 결합하여 다음 단계를 수행합니다.
3. 37°C 인큐베이터(1mL/6웰 플레이트의 웰)에서 0.5mM EDTA 용액을 사용하여 약 5분 동안 줄기 세포 콜로니를 해리합니다.
4. 5분 후 콜로니 형태를 확인합니다. 콜로니 가장자리가 느슨한 틈으로 약간 말려 올라가면 세포가 분화되어 EDTA를 흡인할 준비가 된 것입니다. 그렇지 않은 경우 3....

토론

인간 망막의 가용성이 제한되어 있기 때문에 현재 망막 염증 반응에 대한 우리의 이해는 거의 동물 모델에서 비롯된 것입니다. 이러한 한계를 극복하기 위해 망막 오가노이드를 분화했습니다. 망막 오가노이드 모델의 개발은 질병 모델링 및 치료법 개발을 위해 인간 망막의 복잡성을 요약하는 것을 목표로 하는 활발한 연구 분야입니다. 여러 연구에서 인간 만능 줄기 세포 ^1,.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acctuase	Stemcell Technologies	07920
Advanced DMEM/F12	Thermo	12634-010
Anti-CRX(M02)	abnova	H00001406-M02	Antibody; dilution as per the manufacturer's instructions
Anti-IBA1	Abcam	ab5076	Antibody; dilution as per the manufacturer's instructions
B27	Life Technologies	17105-041
Dispase (1U/mL)	Stemcell Technologies	07923
DMEM basic	Gibco	10566-016
DMEM/F12	Gibco	10565-042
DPBS	Gibco	C141905005BT
EDTA	Thermo	15575020
F12	Gibco	11765-054
FBS	Biological Industry	04-002-1A
Gelatin	Sigma	G7041-100G	Solid
Glutamax	Gibco	35050-061
H9 cell line	WiCell Research Institute
IL-3	RD Systems	203-IL-050
IL-34	PeproTech	200-34-50UG
KSR	Gibco	10828028
Matrix	Corning	356231
M-CSF	RD Systems	216-MC-500
MEM Non-essential Amino Acid Solution	Sigma	M7145
N2	Life Technologies	17502-048
Neurobasal	Gibco	21103-049
Pen/strep	Gibco	15140-122
Stem cell medium	Stemcell Technologies	5990
Taurine	Sigma	T-8691-25G
X-ViVO	LONZA	04-418Q
Y27632	Selleck	S1049
β-mercaptoethanol	Life Technologies	21985-023