담배 연기 추출물로 자극된 쥐 기도 상피 세포에서 다중-오믹스의 분화 및 변화를 연구하기 위한 시험관 내 모델

요약

여기에서는 만성 담배 연기 추출물(CSE)에 대한 적응에 초점을 맞춘 쥐 기도 상피 세포를 분리하고 분화하기 위한 시험관 내 모델을 설명합니다. 이 모델은 CSE의 다중 오믹스 영향을 종합적으로 특성화하는 데 활용될 수 있으며, 이는 만성 연기 노출 시 세포 반응에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다.

초록

만성 폐쇄성 폐질환(COPD)은 주로 담배 연기 노출에 기인합니다. 기도 상피 세포가 담배 연기에 기능적으로 적응하는 방법을 조사하는 것은 COPD의 발병 기전을 이해하는 데 매우 중요합니다. 본 연구는 담배 연기의 실제 영향을 모방하기 위해 일차 쥐 기도 상피 세포를 사용하여 시험관 내 모델을 설정하는 것이었습니다. 확립된 세포주와 달리 일차 세포는 성장 패턴, 노화 및 분화를 포함한 in vivo와 유사한 특성을 더 많이 유지합니다. 이 세포는 민감한 염증 반응과 효율적인 분화를 나타내므로 생리적 상태를 밀접하게 나타냅니다. 이 모델에서는 최적 농도의 담배 연기 추출물(CSE)을 사용하여 공기-액체 계면에서 28일 동안 배양한 결과, 미분화 세포의 단층이 CSE 순응을 나타내는 가성층화된 원주 상피로 변형되었습니다. 그런 다음 CSE가 기저 기도 세포의 분화에 영향을 미치는 메커니즘을 밝히기 위해 포괄적인 다중 오믹스 분석을 적용했습니다. 이러한 통찰력은 담배 연기 노출에 대한 반응으로 COPD 진행을 뒷받침하는 세포 과정에 대한 심층적인 이해를 제공합니다.

서문

만성 폐쇄성 폐질환(COPD)은 복잡한 특성을 가진 이질적인 폐 질환이며, COPD 환자는 점차 젊어지는 경향이 있습니다¹. COPD²의 주요 위험 요인인 흡연은 담배 연기에 대한 초기 장벽 역할을 하는 기도 상피 세포에 지대한 영향을 미칩니다. 이러한 알려진 연관성에도 불구하고, 담배 연기가 기도 상피 세포의 변화를 유도하는 자세한 메커니즘은 여전히 충분히 연구되지 않았습니다. 이러한 분자 변화에 대한 철저한 이해는 COPD의 조기 진단 마커와 치료 표적을 식별하는 데 필수적입니다.

이 간극을 해결하기 위해 우리는 쥐 기도 상피 세포를 사용하는 새로운 in vitro 모델을 개발했습니다. 이 세포는 담배 연기 추출물(CSE)로 장기간 자극을 받았기 때문에 역동적인 세포 변화를 모니터링하고 장기 담배 자극 하에서 기도 상피 세포의 변화와 기전을 조사할 수 있었습니다. 이 모델에서는 기도 상피 세포의 공기-액체 인터페이스를 제공하기 위해 transwell을 사용하였으며, 담배 연기 추출물은 상피 세포 분화의 초기 단계에서 28일에 분화가 끝날 때까지 자극되었습니다. 이전 연구에서는 기도 상피 세포(세포주 우성)의 분화와 단기 자극만 조사했습니다....

프로토콜

전체 프로토콜은 쥐 기관에서 분리된 기도 상피 세포의 준비에 1일, 세포 증식에 15일, 공기-액체 계면에서 CSE 자극에 28일을 포함하여 44일이 필요합니다. 모든 실험동물은 캐피탈의과대학 동물실험센터 SPF 배리어동물실에 수용되며, 캐피탈의과대학 동물실험 및 실험동물윤리위원회(AEEI-2020-100)의 검토 및 승인을 받아 ARRIVE 가이드라인⁷의 요구사항을 충족합니다.

1. 쥐 기관에서 원발성 쥐 기도 상피 세포의 분리

1. 준비
   1. 50x 보충제 1mL와 하이드로코르티손 스톡 0.05mL를 48.95mL 팽창 기저 배지와 결합하여 완전한 팽창 배지를 준비합니다. 4 °C에서 보관하고 4주 이내에 사용하십시오.
   2. 7.5mg의 proteinase와 5mg의 deoxyribonuclease I을 Ham's F-12 5mL에 용해시켜 proteinase 용액을 준비합니다. 여과하여 멸균하여 4 °C에서 보관하고 4 주 이내에 사용하십시오.
   3. 0.05mL의 100x 페니실린/스트렙토마이신과 0.01mL의 500x 겐타마이신/암포테리신을 5mL의 완전 팽창 배지, PBS 및 단백질 분해효소 용액(100U/mL 페....

토론

COPD는 흔한 만성 기도 염증성 질환입니다. 담배 연기에 노출되면 만성 기도 염증, 기도 재형성 및 폐 구조 파괴가 발생하는데, 이는 다양한 구조 세포와 면역 세포의 상호 작용의 결과입니다¹⁰. 폐의 선천성 면역 체계의 최전선인 기도 상피 세포는 질병 발병 과정에서 매우 중요한 역할을 합니다¹¹. 이러한 관점에서 상피 세포가 유해 물질의 자극에 의해 하류 세?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
100x Penicillin/Streptomycin solution	Gibco	15140122
24 mm Transwell with 0.4 µm Pore Polyester Membrane Insert, Sterile	BIOFIL	TCS016012
40 µm Cell Strainer	Falcon	352340
500x Gentamicin/Amphotericin Solution	Gibco	R01510
acetylated α-Tubulin	CST	#5335
Acetyl-α-Tubulin (Lys40) (D20G3)XP Rabbit mAb	cellsignal	#5335
Animal Component Free Cell Dissociation Kit	Stemcell	05426
Anti-pan Cytokeratin antibody	abcam	ab7753
Cigarette	Marlboro
Claudin3	immunoway	YT0949
Deoxyribonuclase I from bovine pancreas	Sigma-Aldrich	DN25
Deoxyribonuclase I from bovine pancreas	Sigma	DN25
Ham’s F-12	Sigma-Aldrich	N6658
Heparin Solution	Stemcell	07980
Hydrocortisone Stock Solution	Stemcell	07925
Mucin 5AC	abcam	ab212636
Occludin	proteintech	27260-1-AP
PBS	Cytosci	CBS004S-BR500
Penicillin-Streptomycin Solution	Gibco	15140122
PneumaCult-ALI Basal Medium	Stemcell	05002
PneumaCult-ALI 10x Supplement	Stemcell	05003
PneumaCult-ALI Maintenance Supplement	Stemcell	05006
PneumaCult-Ex Plus 50x Supplement	Stemcell	05042
PneumaCult-Ex Plus Basal Medium	Stemcell	05041
Pronase E	Sigma-Aldrich	P5147
Rat tail collagen	Corning	354236
Trypan Blue	Stemcell	07050