이 프로젝트는 공중 보건의 일리노이학과와 국립 과학 재단 (DBI - 0852416)에 의해 재정 지원되었다.

1. 장치 기능 <ol><li> hypoxic 삽입 장치는 6 기둥을 포함하는 표준 6 자 플레이트로 둥지. 가스 기둥의 바닥에 microfluidic 네트워크를 통해, 기둥으로 흐르고, 밖 장치의 뒤로 흐르고 있습니다. microchannel 하단의 장벽을 형성 기둥의 기지에서 microchannel 가스와 문화 미디어 사이의 산소 확산을 허용 100 μm의 두께 가스 투과 PDMS 막입니다. 따라서 장치가 원하는 가치를 향한 미디어 산소 농도를 드라이브 농도 기울기를 설립하여 운영하고 있습니다. </li><li> 장치가 hypoxic 챔버 및 기타 세포 산소 시스템 이상의 장점을 다수 제공합니다 : 1 건)) 빠른 시간적 제어, 2 허용 산소 확산 경로를 최소화 기둥 microchannel 디자인, 3과 같은 종속 산소 이상의 공간적 제어) 향상을 가지고 작은 연구실 풋프린트 및 실험 효율성을 높이기 위해 높은 처리량, 그리고 4) 전문 지식과 장비에 대한 요구하지 않고 일반 세포 배양 도구 (예 : multiwell 판)에 적응. </li></ol> 2. 장치 제조 <ol><li> 먼저 기둥 배열은 이전에 가공 Delran 금형의 PDMS와 몰드 복제됩니다. </li><li> 가스 다음 각 기둥의 하단에 microchannel 표준 SU - 8 석판술 및 PDMS 복제 성형을 사용하여 조작합니다. </li><li> 가스 투과 막은 원하는 두께를 달성하기 위해 실리콘 웨이퍼에 대한 PDMS의 정의 회전에 의해 조작됩니다. 이 예제에서는 10 초 500 RPM 후 30 초 동안 900 rpm을 회전하여 가짜란 100 μm의 두꺼운 막이를 사용합니다. </li><li> 모든 구성 요소는 휴대용 플라즈마 장치 (모델 BD - 20, 전자 기술 제품)와 산소 플라즈마 처리 후 함께 보세 있습니다. </li></ol> 3. 장치 설정 <ol><li> 부드럽게 장치는 거품을 방지해야하고, 접시에 넣습니다. 삽입하는 동안 장치 앵글링하면 한쪽 거품을 추방하는 데 도움이됩니다. 실제 세포 기반 실험의 경우,이 단계는 살균 층류 후드 안에 완료해야합니다. 장치가 삽입되면 오염에 대한 가능성이 크게 감소, 조립이되지 않은 멸균 환경에서 보육에 이월 수 있도록. </li><li> 소스 가스 탱크에서 장치의 입구와 출구 포트에 튜브를 연결합니다. 세포 기반 실험, 문화 인큐베이터는 튜브 항목과 튜브는 장치를 휴대하고 인큐베이터에 넣어 후에 연결되어 있어야합니다을 허용하는 구멍이 있어야합니다. 기본 세포를 부술 정도로 PDMS를 변형 할 수있는 장치에 과도한 압박을 가하고 않도록주의하십시오. </li><li> 정밀 유량 조절이 장치를 넘쳐 방지하기 위해 탱크 톱 조절기를 열기 전에 닫혀 있는지 확인하십시오. 가스의 흐름을 시작합니다. 원하는 유속 (50-100 ML / 분)로 부드럽게 열고 정밀 유량 조절기. 시스템이 유속을 변경, equilibrates 동안 압력 강하의 변화하므로, 다음 시간 동안 밀접하게 가치를보고하고 필요에 따라 조정합니다. 미디어의 거품 형성을 방지하기 위하여, 높은 유량과 초기 십오분 평균 기간 이후 10-20 사이 ML / 분에 유량을 줄일 수 있습니다. </li><li> 원하는 실험 기간 후, 가스 흐름을 중단 접시를 제거하고, 프로세스 세포 그에 따라 (예 : 등, 개수, 얼룩, lyse). </li></ol> 4. 장치 확인 <ol><li> 보정 <ol><li> 형광 산소의 위치의 번호와 위치를 선택하십시오 산소 측정에 사용됩니다 (폭시) 센서 슬라이드 (정품 확인 요구 사항에 따라). 슬라이드 산소에 의해 침묵하는 형광 루테늄 염료의 코팅이 포함되어 있습니다. </li><li> 0, 10 슬라이드 직접 노출하고, 가스 탱크에서 21 %의 산소와 적절한 평균 5 분 후에 이미지를 캡처합니다. </li><li> 형광 강도에 따라 각 위치와 플롯 산소 농도에 대한 의미 이미지 강도를 내보냅니다. </li><li> 00~10% 라인 피팅 선형 곡선과 10~21% 라인에 의해 보정 곡선을 생성합니다. </li></ol></li><li> 이질 <ol><li> 정의된 간격 (예 : 모든 1mm)에서 채널의 넓이를 걸치는 여러 지점을 설정합니다. 간격에 따라 이미지의 중복이있을 수 있습니다. </li><li> 장치를 통해 잘 표면에서 산소 농도를 측정 </li></ol></li><li> 평균 <ol><li> 산소 농도를 측정할 수있는 매력적 슬라이드에 세 개의 지점을 선택합니다. </li><li> 즉시 주위 산소 수준에서 첫 이미지를 캡처 후 장치에 가스 흐름을 시작 정밀 유량 조절기를 엽니다. 산소 concentr의 기간과 정도를 평가하기 위해 적절한 간격으로 이미지를 캡처에이션의 평균 (30 분마다 10 초 예). </li></ol></li></ol> 5. 애플 리케이션 <ol><li> 상처 치유 <ol><li> 실험 하루 전에, 우물에 가스 거품 형성을 억제 줄이기 위해 혈청이없는 배지에서 소독을 PDMS 삽입을 만끽해보세요. </li><li> 6 잘 판에 confluency 100 % 문화 세포. </li><li> 상처를 시뮬레이트하기 위해 p200 피펫 팁과 monolayers에 바로 스크래치를 만듭니다. </li><li> 셀 미디어를 대기음, 5 ML 매체와 린스, 다시 대기음. 세포의 monolayer 방해하지 않는 것이 중요합니다. </li><li> 리필 세포 증식을 감소 4 ML 혈청 무료 매체로 우물. </li><li> 장소는 우물에 삽입하고 해당 산소 농도 각 잘 연결합니다. </li><li> 37 온수 무대에서 삽입과 장소 6 - 잘 플레이트 ° C. </li><li> 원하는 간격과 전체 기간에 세포의 시간 경과 이미지를 캡처합니다. MATLAB의 T_Scratch, 상처 측정 알고리즘은, unhealed 면적을 분석하는 데 사용할 수 있습니다. </li></ol></li></ol> 6. 대표 결과 <ol><li> 장치 확인 hypoxic 삽입 장치는 0.5 % 산소로 안정화 2 분 미만을 필요로하는 산소의 평균 시간과 범위의 측면에서 hypoxic 챔버를 통해 큰 향상을 전시하고 있습니다. 장치 막 - 잘 하단 갑 크기가 큰 간격 크기가 정상 상태 산소 농도 값에 도달하는 더 많은 시간을 필요로, 평균 효율을 결정하는 중요한 요인이되었다. 이 디바이스는 또한 여러 조건의 형성을있게 한 우물에 공간 산소 제어할의 큰 거래를 허용하고, 심지어 잘의 표면에 걸쳐 순환 산소 프로필을 생성. </li><li> 상처 치유 세포 monolayers을 10 % 또는 21% 산소와 상처의 표면 영역에 노출된 것은 시간이 지남에 따라 분석했다. 21 % 산소에 노출 긁힌 자국이 가장 느린와 10 %의 가장 빠른를 마감했다. 그림 1은 17 시간의 과정을 통해 처음의 이미지를 보여줍니다. 그림 5의 그래프는 실험 기간 동안 두 산소 농도에 대한 개방 상처 영역의 비율을 보여줍니다. </li></ol> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1695/1695fig1.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1695/1695fig1tmb.jpg" alt="그림 1" border="0" /></a> 그림 1. 도식 및 장치 기능을 설명하는 다이어그램. 산소 삽입 장치는 종래의 석판술 (microfluidic 네트워크), 복제 성형 (microfluidic 네트워크 및 삽입 비계)에 의해 조작되며, (가스 투과 막) PDMS의 회전 정의. A) 산소 장치는 6 자 판으로 중첩. B) 24 96 - 웰 기둥 배열의 예. 기둥 C) 횡단면 설계도. 산소 입구를 통해 장치에 흐름과 기둥의 하단에 microfluidic 네트워크를 통해 여행. 산소 자유롭게 기둥 하단의 가스 투과 PDMS 막에 걸쳐 확산과 문화 미디어로 녹아 있습니다. D) 평균 연구에 대한 보세 유리 게시물, 위에서 단일 채널 기둥의 다양한 기능을 보여주는 현미경 이미지. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1695/1695fig2.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1695/1695fig2tmb.jpg" alt="그림 2" border="0" /></a> 그림 2. 산소 센서와 장치의 확인. 각 웰 내에서 산소 장력은 평면 루테늄 산소 센서를 사용하여 묘사했다. 모든 산소 혼합 미디어 버퍼링에 대한 균형 질소와 5% CO 2가 포함되어 있습니다. A) 플롯의 평균 시간과 효과에 게시 높이의 효과를 설명하고, 멤브레인와 세포 사이를 따라서 산소 확산 거리. 높이가 장치의 하단에 바운드 컷 유리 게시물에 의해 설립되었다. 세 게시 크기의 항복 평균 시간이 많은 hypoxic 챔버를 통해 향상되었습니다. 시간은 로그 스케일입니다. B) 플롯은 0.2 mm 간격 장치의 급속한 산소 평균 응답 시간을 묘사. C) 다중 위치 linescans 또한 장치가 도입된 산소 농도의 균질성을 보장하기 위해 microchannel에서 잘 걸쳐 촬영했다. 그래프가 0 %, 10 %, 10 분 21 % 산소를 일으키는 후 측정 산소 농도를 묘사. D) 장치가 효과적으로 오일을 통해 10 %의 산소를 유지합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1695/1695fig3.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1695/1695fig3tmb.jpg" alt="그림 3" border="0" /></a> 그림 3. 더 복잡한 산소 microchannel 디자인 실험. A) 듀얼 조건 microchannel 설정은 안정 0% 14 일 동안 21 % 산소 프로필을 산출. B) 500 μm의 폭 microchannels의 interdigitated과 구불 구 불한 패턴 일에 걸쳐 확장주기적 산소 프로필에 전자 기둥 결과. microchannel 정렬이 어려웠다로 데이터가 한 대표 재판을 묘사합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1695/1695fig5.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1695/1695fig5tmb.jpg" alt="그림 4" border="0" /></a> 그림 4. 상처 폐쇄 0, 7, 초기 스크래치 후 17시간의 Timelapse 이미지. 세포 실험 기간 내내 21 % 산소를 전달했다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1695/1695fig6.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1695/1695fig6tmb.jpg" alt="그림 5" border="0" /></a> 그림 5. 스크래치 분석의 상처 치유 속도에 산소 농도의 영향.

장치는 표준 SU - 8 석판술, 복제 성형 및 방적 및 polydimethylsiloxane의 완전히 만들어진 정의에 의해 조작됩니다. 가스는 원하는 평형 산소 농도으로 시스템을 구동, microchannel 기둥과 문화 미디어 사이의 농도 구배를 구축하기 위해 장치에 도입입니다. 장치가 효과적으로 잘 내부의 시간적 및 공간적 산소를 조절뿐 아니라 적절한 세포 행동을 조절하기 위해 표시되었습니다. 산소의 공간적 patterning는 기둥의 기지에서 microchannel에 의해 정의되고, 디자인의 다양한 photomask를 만들어 구현 될 수 있도록. 또한, 잘의 가스​​ 단계로 원하는 가스의 주입은 평균 시간과 hypoxia의 정도 향상을 위해 예정입니다. microfluidic 혼합 네트워크는 단 몇 재고 가스 탱크에서 소설 가스 혼합물을 생산하는 수단을 제공하는 장치에 맞게 수 있습니다. 마지막으로, 매체 교환을위한 메커니즘은 세포가 반응 수있는의 multiwell 판에서 장치의 제거에 대한 필요성을 제거합니다. 이 장치는 체외 또는 산소 농도 제어를 필요로 전직의 생체내 실험에서 애플 리케이션을했다. 산소는 신호 경로의 대부분에 영향을 미치는 중요한 생리적 변수로서 이익이 될 연구 분야는 연구자의 창의에 의해 제한됩니다. 산소 농도의 향상된 시간적 컨트롤에서 이익을 얻을 수 일부 필드는 많은 사람 중에서 암 전이, 수면 가사, 그리고 심장의 국소 빈혈 reperfusion 상해를 포함합니다. 예를 들어, 간헐 hypoxia은 지속 hypoxia과 normoxia에 비해 metastastis - 관련된 유전자의 숫자를 upregulating 더 침략 암과 상관되었습니다. 공간 제어 산소 그라디언트가 개발, 간 띠 모양 구성, 약물 독성, 그리고 줄기 세포 틈새에 중요한로서 또한 중요합니다. 이 문서에서 제시 장치가 작은 실험실 발자국, 비교적 간단 운영 요구 사항과 세포에 산소 노출을 통해 훨씬 더 제어할 수있는 시스템을 제공함으로써 연구의 영역의 번호를 도움이 될 것입니다.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>PDMS-Sylgard 184</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dow Corning</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Planar FOXY sensor</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ocean Optics</td>
<td>FOXY-SGS-M</td>
<td>Coated microscope slide</td>
</tr>
<tr>
<td>Gas regulator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Omega</td>
<td>FL-1472-G</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gas</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Airgas</td>
<td>Custom mixes</td>
<td>All have 5% CO2</td>
</tr>
<tr>
<td>SU-8 2150</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Microchem</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MDCK Growth Medium w/ L-Glutamine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>SAFC Biosciences</td>
<td>M3803</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fetal Bovine Serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>ATCC</td>
<td>30-2020</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Trypsin-EDTA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>T4049</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-Glutamine solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G7513</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

fabrication and operation of an oxygen insert for adherent cellular cultures 

산소는 많은 세포 통로의 핵심 모듈 레이터이지만, 현재의 장치가 좋으면<em&gt; 체외에서</em&gt; 산소 변조는 생물 의학 연구의 요구를 충족하기 위해 실패합니다. hypoxic 챔버는 표준 문화 혈관에서 산소를 제어하는​​ 간단한 시스템을 제공하고 있지만, 생리 현상의 다양한 공부에 애플 리케이션을 방지, 세포 표면에서 산소 농도 이상의 정확한 시간적 및 공간적 통제 부족합니다. 다른 시스템은 hypoxic 챔버에 따라 개선, 그러나 그들의 작업에 대한 전문적인 지식과 장비를 요구 평균 연구자에 대한 그들을 위협하고있다. multiwell 플레이트에 대한 microfabricated 삽입이보다 효과적으로 찾을 수 더 나은 모델이 생리 현상에 대한 시간적 공간적 및 산소 농도를 제어하기 위해 개발되었습니다<em&gt; 생체내에</em&gt;. 플랫폼은 표준 multiwell 판에 둥지 및 목표 가스 투과 막과 수동 microfluidic 가스 네트워크의 역할은 자기편 세포에 산소 공급을 조절하는 polydimethylsiloxane 인서트로 구성되어 있습니다. 이 장치는 사용하기 간단하며 플랫폼에 원하는 산소 농도를 소개하기 위해 압력을 제공하는 가스 실린더에 연결되어 있습니다. 제조는 실리콘 웨이퍼에 회전 표준 SU - 8 석판술, 복제 성형, 그리고 정의 PDMS의 조합을 포함한다. 장치의 구성 요소는 휴대용 플라즈마 시스템을 사용하여 표면 처리 후 접착합니다. 검증은 평면 형광 산소 센서와 함께 수행됩니다. 평균 시간은 분 순서에 산소 프로필 다양한 찾을 사람을 모방하는 등 본 연구에서 얻은 순환 프로필로 장치 디자인, 심지어 산소 그라디언트에 따라 획득 수<em&gt; 생체내에</em&gt;. 장치 기능의 손실없이 일반적인 방법을 사용하여 세포 배양을위한 소독 수 있습니다. 을 연구하는 장치의 적용<em&gt; 체외에서</em&gt; 상처 치료 반응이 증명됩니다.

Watch this Scientific Journal Video about Fabrication and Operation of an Oxygen Insert for Adherent Cellular Cultures at JoVE.com

Fabrication and Operation of an Oxygen Insert for Adherent Cellular Cultures

6 잘 판의 공간 및 시간적 산소 이상의 향상된 제어를 제공하는 추가 기능에 대한 플랫폼의 제작 및 검증. 이 디바이스는 문화 시스템의 숫자로 적용할 수 있으며, 상처의 치유에 대한 산소의 영향을 조사하는 데 사용할 수 있습니다.

자기편 셀룰러 문화에 대한 산소 삽입 제작 및 운영

Oxygen is a key modulator of many cellular pathways, but current devices permitting in vitro oxygen modulation fail to meet the needs of biomedical ...

fabrication-operation-an-oxygen-insert-for-adherent-cellular

Research

JoVE Journal

Biology

Fabrication and Operation of an Oxygen Insert for Adherent Cellular Cultures 

9.6K 조회수.  University of Illinois. 6 잘 판의 공간 및 시간적 산소 이상의 향상된 제어를 제공하는 추가 기능에 대한 플랫폼의 제작 및 검증. 이 디바이스는 문화 시스템의 숫자로 적용할 수 있으며, 상처의 치유에 대한 산소의 영향을 조사하는 데 사용할 수 있습니다.

비디오: Fabrication and Operation of an Oxygen Insert for Adherent Cellular Cultures

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

Protein function is intimately coupled to protein localization. Although some proteins are restricted to a specific location or subcellular compartment, many proteins are present as a freely diffusing population in free exchange with a sub-population that is tightly associated with a particular subcellular domain or structure. In situ subcellular fractionation allows the visualization of protein compartmentalization and can also reveal protein sub-populations that localize to specific structures. For example, removal of soluble cytoplasmic proteins and loosely held nuclear proteins can reveal the stable association of some transcription factors with chromatin. Subsequent digestion of DNA can in some cases reveal association with the network of proteins and RNAs that is collectively termed the nuclear scaffold or nuclear matrix. 
Here we describe the steps required during the in situ fractionation of adherent and non-adherent mammalian cells on microscope coverslips. Protein visualization can be achieved using specific antibodies or fluorescent fusion proteins and fluorescence microscopy. Antibodies and/or fluorescent dyes that act as markers for specific compartments or structures allow protein localization to be mapped in detail. In situ fractionation can also be combined with western blotting to compare the amounts of protein present in each fraction. This simple biochemical approach can reveal associations that would otherwise remain undetected.

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

In situ subcellular fractionation of mammalian cells on microscope coverslips allows the visualisation of protein localisation.

자기편 및 비 점착 성의 포유 동물 세포의 현장 Subcellular 분별 (분리)에서

Protein function is intimately coupled to protein localization. Although some proteins are restricted to a specific location or subcellular compartment, ...

연구

생물학

Clonogenic Assay: Adherent Cells

The clonogenic (or colony forming) assay has been established for more than 50 years; the original paper describing the technique was published in 19561. Apart from documenting the method, the initial landmark study generated the first radiation-dose response curve for X-ray irradiated mammalian (HeLa) cells in culture1. Basically, the clonogenic assay enables an assessment of the differences in reproductive viability (capacity of cells to produce progeny; i.e. a single cell to form a colony of 50 or more cells) between control untreated cells and cells that have undergone various treatments such as exposure to ionising radiation, various chemical compounds (e.g. cytotoxic agents) or in other cases genetic manipulation. The assay has become the most widely accepted technique in radiation biology and has been widely used for evaluating the radiation sensitivity of different cell lines. Further, the clonogenic assay is commonly used for monitoring the efficacy of radiation modifying compounds and for determining the effects of cytotoxic agents and other anti-cancer therapeutics on colony forming ability, in different cell lines. A typical clonogenic survival experiment using adherent cells lines involves three distinct components, 1) treatment of the cell monolayer in tissue culture flasks, 2) preparation of single cell suspensions and plating an appropriate number of cells in petri dishes and 3) fixing and staining colonies following a relevant incubation period, which could range from 1-3 weeks, depending on the cell line. Here we demonstrate the general procedure for performing the clonogenic assay with adherent cell lines with the use of an immortalized human keratinocyte cell line (FEP-1811)2. Also, our aims are to describe common features of clonogenic assays including calculation of the plating efficiency and survival fractions after exposure of cells to radiation, and to exemplify modification of radiation-response with the use of a natural antioxidant formulation.

The applicability of the clonogenic assay for evaluating reproductive viability has been established for more than 50 years. Here we demonstrate the general procedure for performing the clonogenic assay with adherent cells.

Clonogenic 분석 : 자기편 셀

The clonogenic (or colony forming) assay has been established for more than 50 years; the original paper describing the technique was published in 19561. ...

An Analytical Tool that Quantifies Cellular Morphology Changes from Three-dimensional Fluorescence Images

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for inclusion and exclusion of data points, and computer-aided pattern recognition to support the interpretation and findings of the analysis. It has become increasingly important to be able to measure fluorescence images constructed from three-dimensional (3D) datasets in order to be able to capture the complexity of cellular dynamics and understand the basis of cellular plasticity within biological systems. Sophisticated microscopy instruments have permitted the visualization of 3D fluorescence images through the acquisition of multispectral fluorescence images and powerful analytical software that reconstructs the images from confocal stacks that then provide a 3D representation of the collected 2D images. Advanced design-based stereology methods have progressed from the approximation and assumptions of the original model-based stereology1 even in complex tissue sections2. Despite these scientific advances in microscopy, a need remains for an automated analytic method that fully exploits the intrinsic 3D data to allow for the analysis and quantification of the complex changes in cell morphology, protein localization and receptor trafficking. 
Current techniques available to quantify fluorescence images include Meta-Morph (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) and Image J (NIH) which provide manual analysis. Imaris (Andor Technology, Belfast, Northern Ireland) software provides the feature MeasurementPro, which allows the manual creation of measurement points that can be placed in a volume image or drawn on a series of 2D slices to create a 3D object. This method is useful for single-click point measurements to measure a line distance between two objects or to create a polygon that encloses a region of interest, but it is difficult to apply to complex cellular network structures. Filament Tracer (Andor) allows automatic detection of the 3D neuronal filament-like however, this module has been developed to measure defined structures such as neurons, which are comprised of dendrites, axons and spines (tree-like structure). This module has been ingeniously utilized to make morphological measurements to non-neuronal cells3, however, the output data provide information of an extended cellular network by using a software that depends on a defined cell shape rather than being an amorphous-shaped cellular model. To overcome the issue of analyzing amorphous-shaped cells and making the software more suitable to a biological application, Imaris developed Imaris Cell. This was a scientific project with the Eidgen&ouml;ssische Technische Hochschule, which has been developed to calculate the relationship between cells and organelles. While the software enables the detection of biological constraints, by forcing one nucleus per cell and using cell membranes to segment cells, it cannot be utilized to analyze fluorescence data that are not continuous because ideally it builds cell surface without void spaces. To our knowledge, at present no user-modifiable automated approach that provides morphometric information from 3D fluorescence images has been developed that achieves cellular spatial information of an undefined shape (Figure 1). 
We have developed an analytical platform using the Imaris core software module and Imaris XT interfaced to MATLAB (Mat Works, Inc.). These tools allow the 3D measurement of cells without a pre-defined shape and with inconsistent fluorescence network components. Furthermore, this method will allow researchers who have extended expertise in biological systems, but not familiarity to computer applications, to perform quantification of morphological changes in cell dynamics.

We developed a software platform that utilizes Imaris Neuroscience, ImarisXT and MATLAB to measure the changes in morphology of an undefined shape taken from three-dimensional confocal fluorescence of single cells. This novel approach can be used to quantify changes in cell shape following receptor activation and therefore represents a possible additional tool for drug discovery.

3 차원 형광 이미지에서 세포 형태학의 변경 사항 단정 지을 분석 도구

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for ...

An Explant Assay for Assessing Cellular Behavior of the Cranial Mesenchyme

The central nervous system is derived from the neural plate that undergoes a series of complex morphogenetic movements resulting in formation of the neural tube in a process known as neurulation. During neurulation, morphogenesis of the mesenchyme that underlies the neural plate is believed to drive neural fold elevation. The cranial mesenchyme is comprised of the paraxial mesoderm and neural crest cells. The cells of the cranial mesenchyme form a pourous meshwork composed of stellate shaped cells and intermingling extracellular matrix (ECM) strands that support the neural folds. During neurulation, the cranial mesenchyme undergoes stereotypical rearrangements resulting in its expansion and these movements are believed to provide a driving force for neural fold elevation. However, the pathways and cellular behaviors that drive cranial mesenchyme morphogenesis remain poorly studied. Interactions between the ECM and the cells of the cranial mesenchyme underly these cell behaviors. Here we describe a simple ex vivo explant assay devised to characterize the behaviors of these cells. This assay is amendable to pharmacological manipulations to dissect the signaling pathways involved and live imaging analyses to further characterize the behavior of these cells. We present a representative experiment demonstrating the utility of this assay in characterizing the migratory properties of the cranial mesenchyme on a variety of ECM components.

The cranial mesenchyme undergoes dramatic morphogenic movements that likely provides a driving force for elevation of the neural folds1,2. Here we describe a simple ex vivo explant assay to characterize the cellular behaviors of the cranial mesenchyme during neurulation. This assay has numerous applications including being amenable to pharmacological manipulations and live imaging analyses.

두개골 Mesenchyme의 셀룰러 행동을 평가하기위한 Explant 분석

The central nervous system is derived from the neural plate that undergoes a series of complex morphogenetic movements resulting in formation of the ...

Detecting, Visualizing and Quantitating the Generation of Reactive Oxygen Species in an Amoeba Model System

Reactive oxygen species (ROS) comprise a range of reactive and short-lived, oxygen-containing molecules, which are dynamically interconverted or eliminated either catalytically or spontaneously. Due to the short life spans of most ROS and the diversity of their sources and subcellular localizations, a complete picture can be obtained only by careful measurements using a combination of protocols. Here, we present a set of three different protocols using OxyBurst Green (OBG)-coated beads, or dihydroethidium (DHE) and Amplex UltraRed (AUR), to monitor qualitatively and quantitatively various ROS in professional phagocytes such as Dictyostelium. We optimised the beads coating procedures and used OBG-coated beads and live microscopy to dynamically visualize intraphagosomal ROS generation at the single cell level. We identified lipopolysaccharide (LPS) from E. coli as a potent stimulator for ROS generation in Dictyostelium. In addition, we developed real time, medium-throughput assays using DHE and AUR to quantitatively measure intracellular superoxide and extracellular H2O2 production, respectively.

We adapted a set of protocols for the measurement of reactive oxygen species (ROS) that can be applied in various amoeba and mammalian cellular models for qualitative and quantitative studies.

검출 시각화 및 아메바 모델 시스템에서 활성 산소 종의 생성을 정량

Reactive oxygen species (ROS) comprise a range of reactive and short-lived, oxygen-containing molecules, which are dynamically interconverted or ...

Development of an Insert Co-culture System of Two Cellular Types in the Absence of Cell-Cell Contact

The role of secreted soluble factors in the modification of cellular responses is a recurrent theme in the study of all tissues and systems. In an attempt to make straightforward the very complex relationships between the several cellular subtypes that compose multicellular organisms, in vitro techniques have been developed to help researchers acquire a detailed understanding of single cell populations. One of these techniques uses inserts with a permeable membrane allowing secreted soluble factors to diffuse. Thus, a population of cells grown in inserts can be co-cultured in a well or dish containing a different cell type for evaluating cellular changes following paracrine signaling in the absence of cell-cell contact. Such insert co-culture systems offer various advantages over other co-culture techniques, namely bidirectional signaling, conserved cell polarity and population-specific detection of cellular changes. In addition to being utilized in the field of inflammation, cancer, angiogenesis and differentiation, these co-culture systems are of prime importance in the study of the intricate relationships that exist between the different cellular subtypes present in the central nervous system, particularly in the context of neuroinflammation. This article offers general methodological guidelines in order to set up an experiment in order to evaluating cellular changes mediated by secreted soluble factors using an insert co-culture system. Moreover, a specific protocol to measure the neuroinflammatory effects of cytokines secreted by lipopolysaccharide-activated N9 microglia on neuronal PC12 cells will be detailed, offering a concrete understanding of insert co-culture methodology.

In multicellular organisms, secreted soluble factors elicit responses from different cell types as a result of paracrine signaling. Insert co-culture systems offer a simple way to assess the changes mediated by secreted soluble factors in the absence of cell-cell contact.

세포 - 세포 연락이없는 두 세포 유형의 삽입 공동 배양 시스템 개발

The role of secreted soluble factors in the modification of cellular responses is a recurrent theme in the study of all tissues and systems. In an attempt ...

An In Vitro Model for Studying Cellular Transformation by Kaposi Sarcoma Herpesvirus

Kaposi sarcoma (KS) is an unusual tumor composed of proliferating spindle cells that is initiated by infection of endothelial cells (EC) with KSHV, and develops most often in the setting of immunosuppression. Despite decades of research, optimal treatment of KS remains poorly defined and clinical outcomes are especially unfavorable in resource-limited settings. KS lesions are driven by pathological angiogenesis, chronic inflammation, and oncogenesis, and various in vitro cell culture models have been developed to study these processes. KS arises from KSHV-infected cells of endothelial origin, so EC-lineage cells provide the most appropriate in vitro surrogates of the spindle cell precursor. However, because EC have a limited in vitro lifespan, and as the oncogenic mechanisms employed by KSHV are less efficient than those of other tumorigenic viruses, it has been difficult to assess the processes of transformation in primary or telomerase-immortalized EC. Therefore, a novel EC-based culture model was developed that readily supports transformation following infection with KSHV. Ectopic expression of the E6 and E7 genes of human papillomavirus type 16 allows for extended culture of age- and passage-matched mock- and KSHV-infected EC and supports the development of a truly transformed (i.e., tumorigenic) phenotype in infected cell cultures. This tractable and highly reproducible model of KS has facilitated the discovery of several essential signaling pathways with high potential for translation into clinical settings.

An In Vitro Model for Studying Cellular Transformation by Kaposi Sarcoma Herpesvirus

Kaposi sarcoma (KS) is a tumor induced by infection with the oncogenic virus human herpesvirus-8/KS herpesvirus (HHV-8/KSHV). The endothelial cell culture model described here is uniquely suited for studying the mechanisms by which KSHV transforms host cells.

공부 하는 Kaposi 육 종 Herpesvirus에 의해 세포 변환에 대 한 생체 외에서 모델

Kaposi sarcoma (KS) is an unusual tumor composed of proliferating spindle cells that is initiated by infection of endothelial cells (EC) with KSHV, and ...

Real-Time Detection of Reactive Oxygen Species Production in Immune Response in Rice with a Chemiluminescence Assay

Reactive oxygen species (ROS) play vital roles in a variety of biological processes, including the sensing of abiotic and biotic stresses. Upon pathogen infection or challenge with pathogen-associated chemicals (pathogen-associated molecular patterns [PAMPs]), an array of immune responses, including a ROS burst, are quickly induced in plants, which is called PAMP-triggered immunity (PTI). A ROS burst is a hallmark PTI response, which is catalyzed by a group of plasma membrane-localized NADPH oxidases-the RBOH family proteins. The vast majority of ROS comprise hydrogen peroxide (H2O2), which can be easily and steadily detected by a luminol-based chemiluminescence method. Chemiluminescence is a photon-producing reaction in which luminol, or its derivative (such as L-012), undergoes a redox reaction with ROS under the action of a catalyst. This paper describes an optimized L-012-based chemiluminescence method to detect apoplast ROS production in real-time upon PAMP elicitation in rice tissues. The method is easy, steady, standardized, and highly reproducible under firmly controlled conditions.

Here, we describe a method for the real-time detection of apoplastic reactive oxygen species (ROS) production in rice tissues in pathogen-associated molecular pattern-triggered immune response. This method is simple, standardized, and generates highly reproducible results under controlled conditions.

Chemiluminescence Assay를 통한 벼의 면역 반응에서 활성 산소 종 생산의 실시간 검출

Reactive oxygen species (ROS) play vital roles in a variety of biological processes, including the sensing of abiotic and biotic stresses. Upon pathogen ...

An Innovative 3D-Printed Insert Designed to Enable Straightforward 2D and 3D Cell Cultures

The classical analyses of indirect communication between different cell types necessitate the use of conditioned media. Moreover, the production of conditioned media remains time-consuming and far from physiological and pathological conditions. Although a few models of co-culture are commercially available, they remain restricted to specific assays and are mostly for two types of cells. 
Here, 3D-printed inserts are used that are compatible with numerous functional assays. The insert allows the separation of one well of a 6-well plate into four compartments. A wide range of combinations can be set. Moreover, windows are designed in each wall of the compartments so that potential intercellular communication between every compartment is possible in the culture medium in a volume-dependent manner. For example, paracrine intercellular communication can be studied between four cell types in monolayer, in 3D (spheroids), or by combining both. In addition, a mix of different cell types can be seeded in the same compartment in 2D or 3D (organoids) format. The absence of a bottom in the 3D-printed inserts allows the usual culture conditions on the plate, possible coating on the plate containing the insert, and direct visualization by optical microscopy. The multiple compartments provide the possibility to collect different cell types independently or to use, in each compartment, different reagents for RNA or protein extraction. In this study, a detailed methodology is provided to use the new 3D-printed insert as a co-culture system. To demonstrate several capacities of this flexible and simple model, previously published functional assays of cell communication were performed in the new 3D-printed inserts and were demonstrated to be reproducible. The 3D-printed inserts and the conventional cell culture using conditioned media led to similar results. In conclusion, the 3D-printed insert is a simple device that can be adapted to numerous models of co-cultures with adherent cell types.

In this paper, a newly designed 3D-printed insert is presented as a model of co-culture and validated through the study of the paracrine intercellular communication between endothelial cells and keratinocytes.

간단한 2D 및 3D 세포 배양이 가능하도록 설계된 혁신적인 3D 프린팅 인서트

The classical analyses of indirect communication between different cell types necessitate the use of conditioned media. Moreover, the production of ...

망막 색소 상피 식세포작용 및 리포푸신 축적 정량화

Improved Lipofuscin Models and Quantification of Outer Segment Phagocytosis Capacity in Highly Polarized Human Retinal Pigment Epithelial Cultures

The daily phagocytosis of photoreceptor outer segments by the retinal pigment epithelium (RPE) contributes to the accumulation of an intracellular aging pigment termed lipofuscin. The toxicity of lipofuscin is well established in Stargardt's disease, the most common inherited retinal degeneration, but is more controversial in age-related macular degeneration (AMD), the leading cause of irreversible blindness in the developed world. Determining lipofuscin toxicity in humans has been difficult, and animal models of Stargardt's have limited toxicity. Thus, in vitro models that mimic human RPE in vivo are needed to better understand lipofuscin generation, clearance, and toxicity. The majority of cell culture lipofuscin models to date have been in cell lines or have involved feeding RPE a single component of the complex lipofuscin mixture rather than fragments/tips of the entire photoreceptor outer segment, which generates a more complete and physiologic lipofuscin model. Described here is a method to induce the accumulation of lipofuscin-like material (termed undigestible autofluorescence material, or UAM) in highly differentiated primary human pre-natal RPE (hfRPE) and induced pluripotent stem cell (iPSC) derived RPE. UAM accumulated in cultures by repeated feedings of ultraviolet light-treated OS fragments taken up by the RPE via phagocytosis. The key ways that UAM approximates and differs from lipofuscin in vivo are also discussed. Accompanying this model of lipofuscin-like accumulation, imaging methods to distinguish the broad autofluorescence spectrum of UAM granules from concurrent antibody staining are introduced. Finally, to assess the impact of UAM on RPE phagocytosis capacity, a new method for quantifying outer segment fragment/tips uptake and breakdown has been introduced. Termed "Total Consumptive Capacity", this method overcomes potential misinterpretations of RPE phagocytosis capacity inherent in classic outer segment "pulse-chase" assays. The models and techniques introduced here can be used to study lipofuscin generation and clearance pathways and putative toxicity.

저자 스포트라이트: Improved Lipofuscin Models and Quantification of Outer Segment Phagocytosis Capacity in Highly polarized Human Retinal Pigment Epithelial Cultures  

This protocol describes a lipofuscin accumulation model in highly differentiated and polarized human retinal pigment epithelial (RPE) cultures and an improved outer segment (OS) phagocytosis assay to detect the total OS consumption/degradation capacity of the RPE. These methods overcome the limitations of previous lipofuscin models and classical pulse-chase outer segment phagocytosis assays.

The daily phagocytosis of photoreceptor outer segments by the retinal pigment epithelium (RPE) contributes to the accumulation of an intracellular aging ...