우리는 Imaris, Imaris XT와 MATLAB의 사용에 대한 캘리포니아의 생물 이미징 개발 센터 (BIDC) 대학, 샌프란시스코 감사합니다. 우리는 기술 지원 및 헨리, LK Floren, 원고의 편집에 대한 그들의 공헌에 대한 L. Daitch AT V. Kharazia 감사드립니다. 1R21DA029966-01과 약국의 세브 UCSF 학교에 MLSMR 컬렉션을 화면으로 NIH 패스트 트랙 상 (:이 작품은 세브 국립 보건원에 UCSF을 통해 알코올 및 약물 중독에 캘리포니아 의료 연구의 주에서 자금에 의해 지원되었다 딘의 사무실 및 임상 약학)와 CLHK에 의학 대학 (임상 약리학 및 실험 치료학).

1. 단일 셀 Phenotypic 변경의 세 가지 차원 Morphometric 분석 <ol><li> 인간 배아 신장 (HEK293) 세포와 transfected 된 적혈구 응집소 (HA) corticotropin이 같은 G 단백질 결합 수용체 (GPCR)는 이전 4 5 요소 수용체-2 (CRF-R2) 설명 릴리스 태그. </li><li> 세포는 (AS CRF-R2의 내생의 리간드, corticotropin 방출 인자, CRF (1 μM, 30 분) 또는 선택적 CRF-R2 길항제, 항 sauvagine 30과 pretreated와 자극, (NO 치료, NT) 치료 남은 -30, 1 μM, 작용제 치료 이전 30 분). </li><li> 세포는 다음 고정 per​​meabilized 및 안티 HA로 치료했다. CRF-R2 알렉사 594 nm의 공액 안티 - 마우스 (IgG 1) 항체를 사용하여 시각화했다. DAPI는 핵의 mitotic 단계를 시각화하는 데 사용되었다. </li><li> 실험을 주관를 제한하려면 실험 조건은 이미지를 획득하여 분석 하였다 전까지는 알려져 있지 않았습니다. </li><li> 우리는 이미지를 획득베르디 - V5 레이저와 미라 900-F 레이저 시스템 구성 코 히어 런트 통합 두 광자 레이저 시스템에 연결 계획 - 고차 색지움 63x/1.4 오일 DIC 목표와 Zeiss LSM 510 META 공 촛점 현미경을 사용하여 고정 HEK293 세포에서 s입니다. </li><li> 데이터 수집 과정에서 세포는 모두 바깥 쪽 세포 수용체에 핵 막에서 데이터를 포함하는 multispectral sectioning, 488 nm의, 그리고 790 nm의 (~ 350 nm의 2ph​​ 예.) 및 z-분할 (0.5 μm 단위)에 의해 compartmentalized되었습니다 극단. </li><li> 형광 데이터가 처음 3D 현미경 데이터 세트의 시각화 및 세분화 할 수 있습니다 Imaris를 사용하여 처리되었고, 입방 voxels로 구성된 3D 모델은 morphometric 분석을 위해 만들어졌습니다. 그런 다음 Imaris XT 모듈은 GPCR 확장의 좌표 위치를 결정하기 위해 MATLAB 컴퓨터 프로그램 언어 인터페이스 Imaris로 활용되었다. 계정 세포 다양성을 고려하기 위해, 우리는 형광 이미지 치 렀어를 획득하고 분석22 세포에서 전용 : 작용제 치료 (N = 7) 이전없이 처리 (NT) (N = 7), 작용제 (CRF) 처리 (N = 8) 및 길항제와 사전 처리 (AS-30) (그림 2) . <ol><li> 관심 지역 (ROI)은 활성 mitotic 단계에 있지와 다른 셀에 닫지 한 셀이 포함되어야합니다. 이러한 방법으로 분석 한 핵 및 수용체 확장과 세포가 다른 세포의 가까이에 어리둥절하지 않습니다 포함됩니다. </li><li> 셀룰러 3D 구조가 먼저 Imaris (v.7.1.1)를 사용하여 multispectral 형광 데이터를 복원되었다. </li><li> Imaris가 설계 한 알고리즘을 따라 먼저 표면 렌더링은 핵 멤브레인을 나타 내기 위해 이용되었다. 투자 수익 (ROI)에서 하나 이상의 핵이있을 경우 Imaris를 결정합니다. </li><li> 그런 다음 명소 - 생성 알고리즘은 CRF-R2 확장을 찾습니다 활용되었다. 가 배경 소음의 불규칙 강도에 대한 보상 때문 명소 감지를 활용 한비정질 모양의 세포의 복잡한 네트워크. </li><li> CRF-R2의 형광 검출의 각 단위의 포함을 극대화하려면 명소 &#39;직경은 가우스 필터를 사용하여 측정 강도의 형태로 뚜렷한 정보를 추정 할 수있는 이미지 내의 가장 작은 단위입니다 0.2 μm로 설정되었습니다. 스팟 필터링이 명소 자동 생성 과정에 통합되었습니다. 이 소프트웨어는하지만, 사용자에게 매개 변수를 정의하는 필터를 사용하여 할 수있는 유연성을 제공합니다. </li><li> 데이터 잘림을 방지하려면 데이터 세트는 32 비트의 십진수로 8 비트 (서명) 고정 소수점에서 개조되었습니다. </li><li> voxel 농도 데이터는 참조 점 (그림 3)과 같이 핵 멤브레인을 사용하여 거리 변환을 수행하여 결정되었습니다 Imaris XT의 MATLAB과 인터페이스 모듈과 각 지점의 정확한 공간 위치를 사용하여 좌표 데이터를 파악하기 위해 교환했다. </li></ol></li><li> 그 결과 데이터는 s에 대한 정량화 및 그래픽 형식으로 제시 될 수 있습니다tatistical 분석. 그룹 간의 비교는 양방향 ANOVA와 Bonferroni posttest를 사용하여 수행되었습니다. 데이터는 의미 ± SD를로 제공됩니다. 차이는 * P는 &lt;0.05에서 중요한 것으로 간주됩니다. 계산 GraphPad의 프리즘 5.02 (그림 4)로 만들어졌다. </li></ol> 2. 대표 결과 접근의 힘을 보여하기 위해, 우리는 세포 변화를 정량화이 G 단백질 결합 수용체 (GPCRs)와 corticotropin 방출 인자 transfected HEK293 세포에서의 내생 리간드 CRF있는 수용체-2 (CRF-R2)의 상호 작용 따른 모든 책임은 사용자에게 있습니다. 우리는 CRF-R2 수용체는 세포 (그림 2A와 영화 1) 멤브레인의 유한 지역의 플라즈마 막 및 프로젝트에있는 것을 보여줍니다. 기존의 2D 분석 사용하면, 우리가 수용체 부착 PO를 분석하는 경우에만 세포 CRF-R2 수용체의 하위 집합을 감지 할 수 있습니다유리에 ints이 적용됩니다. 따라서 우리는 Z-스택 multispectral 데이터 (그림 5)에서 파생 된 다른 정보를 잃게됩니다. 플라즈마 막에서 장소 거리의 감소에 의해 그림과 같이 셀이 CRF로 치료하는 경우, 세포 수용체가 크게 감소하고 있습니다. 또한 분리 된 지역의 수 (그림 2B와 영화 2)에 주로 유한 위치에서 배포됩니다. 수용체 막 배포 CRF의 효과는 CRF-R2 특정 길항제, antisavagine 30 일 (AS-30) 전처리에 의해 방지하고 우리는 CRF-R2 확장 (그림 2C와 영화 3) 변경되지 않는 것을 발견합니다. 장소의 말초 배포, 5 μm 스펙트럼 컬러 코딩 간격으로 해본 핵 막에서 voxels의 거리를 시각화하기 위해 사용됩니다. 어떤 치료 및 길항제 pretreatm 없습니다다닐이 (AS-30, 1 μM, 30 분) 작용제 치료 (CRF, 1 μM, 30 분) 전에 GPCR의 수축에 중요한 (NS) 차이를 보여 없습니다. 더 치료, 0-5 μm (NS), 6-15 μm (에 비해 작용제 (CRF, 1 μM, 30 분)과 세포의 치료는 점점 CRF-R2 함유 voxels의 수를 감소 ** P &lt; 0.01) 및&gt; 15 μm (*** P &lt;0.005) 또는 AS-30 처리, 0-10 μm (NS), 11-15 μm (비교 ** P &lt;0.01)와&gt; 15 μm (*** P &lt;0.005) (그림 4). <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/4233/4233fig1.jpg" /> 1 그림. 현재 사용 가능한 기술과 형광 이미지를 분석하기 위해 제한의 다이어그램. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4233/4233fig1large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/4233/4233fig2.jpg" /> <strong&gt; 그림 2. 작용제 및 길항제 치료 전후 HA-CRF-R2와 HEK293 transfected 세포의 3D multispectral 형광 이미지. 표시 병합 이미지 안티 - HA를 사용 HA-CRF-R2는 - 탐색과 알렉사 488 복합 항 마우스 (IgG 1) 이차 항체를 사용하여 시각화, DAPI는 핵을 시각화하는 데 사용되었다. 이미지는 공 촛점 레이저 스캐닝 (CLS) 현미경으로 획득했다. 스케일 바 5 μm. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/4233/4233fig3.jpg" /> 그림 3은. HA-CRF-R2와 HEK293 transfected 세포의 3D 모델은 Imaris 소프트웨어를 사용하여 CLS 이미지에서 복원. 작은 소포로 변환 GPCR 확장을 설명하는 핵 및 명소 생성의 표면 렌더링. 형광 데이터가 처음 3D 현미경 데이터 집합의 시각화 및 세분화 할 수 있습니다 Imaris을 사용하여 처리 하였다. 그런 다음, Imaris XT는 MATLAB과 인터페이스 Imaris로 활용되었다. voxel 농도는로 교환되었다장소 맡고있다. 명소 스펙트럼 코딩 된 색상 (파란색 0-5 μm, 녹색, 6-10 μm, 노란색 11-15 μm과 빨간색&gt; 15 μm) 거리 형태 핵 멤브레인을 나타냅니다. 5 μm 크기를 조정. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/4233/4233fig4.jpg" /> 그림 4. 장소의 말초 배포의 그래픽 표현을 5 μm 간격으로 코딩 된 스펙트럼 색에 해본는 핵 막에서 voxels의 거리를 시각화하기 위해 사용됩니다. 작용제 치료 전에 길항제 (AS-30, 1 μM, 30 분) (CRF, 1 μM, 30 분)를 가진 치료 및 전처리는 GPCR의 수축에 중요한 (NS) 차이를 보여 없습니다. 더 치료를 0-5 μm (NS), 6-15 μm을 (** P 비해 작용제 (CRF, 1 μM, 30 분)과 세포의 치료는 점점 CRF-R2 함유 voxels의 수의 거리를 감소 &lt;0.01)와&gt; 15 μm (*** P &lt;0.005), 또는 AS-30 치료 0-10 μm (NS), 11-15<html> μm (** P &lt;0.01)와&gt; 15 μm (*** P &lt;0.005). <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/4233/4233fig5.jpg" /> 그림 5. HA-CRF-R2와 HEK 293 transfected 세포의 2D morphometric 분석의 제한. 핵의 중심을 보여주는 세포의 중간 평면 섹션 (유리 coverslip 위에 3 4μm)는 DAPI와 HA-CRF-R2와 시각화 안티 - HA를 사용 탐지 및 알렉사 488nm 복합 안티 - 마우스 (IgG 1) 차를 사용하여 시각화 수용체 부착 지점은 크게 다릅니다 동안 항체와 CLS와 함께 인수는 (A) 노 처리 (NT)와 (B) 작용제 (CRF, 1 μM, 30 분) 사이에 차이점을 보여줍니다 없습니다. 영화는 1. 자유롭게 HA-CRF-R2, 아니 치료와 293 transfected 세포는 수용체 단백질 중 세포 표현형의 차이를 평가하는 HEK의 &quot;초과&quot;모드에서 3D 모델을 회전. 5-20 μm의 크기 바./ files/ftp_upload/4233/4233movie1.avi &quot;대상 =&quot;_blank &quot;&gt; 영화를 보려면 여기를 클릭하십시오. 자유롭게 HA-CRF-R2, 작용제 치료로 293 transfected 세포가 HEK의 &quot;초과&quot;모드에서 3D 모델을 회전 영화 2., CRF (CRF, 1 μM, 30 분) 수용체 단백질 중 세포 표현형의 차이를 평가합니다. 5-20 μm에서 규모 바. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4233/4233movie2.avi" target="_blank">동영상을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 영화 3. 자유롭게 HA-CRF-R2, 작용제 치료 전에 길항제 (AS-30, 1 μM, 30 분)로 전처리 (CRF, 1 μM, 30 분으로 293 transfected 세포는 HEK의 &quot;초과&quot;모드에서 3D를 회전 ) 수용체 단백질 중 세포 표현형의 차이를 평가합니다. 5-20 μm에서 규모 바. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4233/4233movie3.avi" target="_blank">동영상을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

우리는 CRF 치료가 중요한 형태의 변화와 CRF-R2의 위치를​​ 유도 것으로 나타났다. CRF-R2의 변경 사항은 선택적 길항제 치료에 의해 저해되었다. 우리는 수용체 수정이 표준 2D multispectral 기술을 사용하여 감지되지 않은 및 측정 할 수없는 것으로 나타났다. 복잡한 3D 이미지를 연구 할 수있는 능력은 morphometric 분석을 위해 생물학적 매개 변수의 복잡성을 반영하는 것이 중요합니다. 우리는 일관성 ...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 (선택 사항) </td></tr><tr><td> 인간 배아 신장 (HEK293) </td><td> 미국 유형 문화 수집 </td><td> CRL-1573 </td><td></td></tr><tr><td> Dulbecco의 수정 된 이글 중간 (DMEM) </td><td> Invitrogen </td><td> 11965118 </td><td></td></tr><tr><td> 태아 소 혈청 (FBS) </td><td> Invitrogen </td><td> SH30070.03 </td><td></td></tr><tr><td> AlexaFluor-488 (IgG2b) </td><td> Invitrogen </td><td> A-11001 </td><td></td></tr><tr><td> 단클론 항 HA.11 (IgG 1) </td><td> Covance </td><td> 16B12 </td><td></td></tr><tr><td> DAPI </td><td> 벡터 연구소 </td><td> H-1200 </td><td>; </td></tr><tr><td> CRF </td><td> 시그마 </td><td> C2917 </td><td></td></tr><tr><td> Antisauvagine-30 (AS-30) </td><td> 시그마 </td><td> A4727 </td><td></td></tr></tbody></table>

an analytical tool that quantifies cellular morphology changes from three-dimensional fluorescence images

형광 이미지를 측정에 사용할 수있는 가장 일반적인 소프트웨어 분석 도구는 데이터 요소 및 분석의 해석 및 결과를 지원하는 컴퓨터 지원 패턴 인식을 포함 및 제외에 대한 수동 설정에 의존 (2D) 2 차원 데이터입니다. 그것은 세포 역학의 복잡성을 캡처 및 생물학적 시스템 내에서 세포 소성의 기초를 이해 할 수하기 위해 (3D) 입체 데이터 세트로 구성 형광 이미지를 측정 할 수 있도록 점점 더 중요 해지고있다. 정교한 현미경 악기는 multispectral 형광 이미지와 다음 수집 된 2D 이미지의 3D 표현을 제공하는 공 촛점 스택에서 이미지를 reconstructs 강력한 분석 소프트웨어의 인수를 통해 3D 형광 이미지의 시각화를 허용하고 있습니다. 고급 디자인 기반 stereology 방법은 origina의 근사와 가정에서 진행 한복잡한 조직 섹션 2 리터 모델을 기반 stereology 1. 현미경에서 이러한 과학적 진보에도 불구하고, 필요 완전히 세포 형태, 단백질 지역화와 수용체 거래의 복잡한 변화의 분석 및 정량화 할 수 있도록하기 위해 고유 3D 데이터를 이용하는 자동화 된 분석 방법으로 남아있다. 형광 이미지를 수량화 할 수 현재 기술은 메타 Morph (분자 장치, 서니 베일, CA) 및 수동 분석을 제공합니다 이미지 J (NIH)가 포함되어 있습니다. Imaris (ANDOR 기술, 벨파스트, 북 아일랜드) 소프트웨어는 볼륨 이미지에 배치하거나 3D 객체를 생성하기 위해 2D 슬라이스 일련의 발행 할 수 있습니다 측정 포인트의 수동 생성을 수있는 기능 MeasurementPro을 제공합니다. 이 방법은 두 객체 사이의 선 거리를 측정하거나 관심있는 지역을 둘러싼 다각형을 만들려면 한 번만 클릭하면 포인트 측정에 유용하지만, compl에 적용하기가 어렵습니다예 셀룰러 네트워크 구조. 필라멘트 추적기 (ANDOR)는하지만,이 모듈은 이러한 수석, axons과 쪽 (구조 나무 등)으로 구성되어 있습니다 뉴런과 같은 정의 구조를 측정하기 위해 개발 된 필라멘트과 같은 3D neuronal 자동으로 감지 할 수 있습니다. 이 모듈은 ingeniously 비 neuronal 세포 3 형태학의 측정을하기 위해 사용되어 왔습니다 그러나, 출력 데이터 오히려 비정질 모양의 휴대폰 모델 것보다 정의 된 셀 모양에 따라 소프트웨어를 사용하여 확장 셀룰러 네트워크의 정보를 제공합니다. 비정질 모양의 세포를 분석하고 생물학적 응용 프로그램 소프트웨어가 더 적합의 문제를 극복하기 위해 Imaris은 Imaris 셀을 개발했다. 이 세포와 세포 기관 사이의 관계를 계산하기 위해 개발 된 Eidgenössische Technische Hochschule과 과학 프로젝트를했습니다. 소프트웨어는 세포 당 하나의 핵을 강요하여, 생물 제약의 검출을 가능하게하는 동안그리고 세그먼트 셀에 셀 멤브레인을 사용하여, 그것은 이상적으로는 무효 공간없이 세포 표면을 구축하기 때문에 연속되지 형광 데이터를 분석하기 위해 이용 될 수 없습니다. 우리의 지식으로, 현재 3D 형광 이미지에서 morphometric 정보를 제공합니다는 사용자가 수정할 수 자동화 접근 방식은 정의되지 않은 형태 (그림 1)의 세포 공간 정보를 달성 개발되지 않았습니다. 우리는 MATLAB (매트 작품 주식회사)에 인터페이스 Imaris 핵심 소프트웨어 모듈 및 Imaris XT를 사용하여 분석 플랫폼을 개발했습니다. 이 도구는 미리 정의 된 모양없이 일관성 형광 네트워크 구성 요소와 세포의 3D 측정을 할 수 있습니다. 또한,이 방법은 세포 역학에 형태학의 변화를 정량화을 수행하는 컴퓨터 응용 프로그램에 익숙 생물 시스템에 전문 지식을 확장하지만,하지 않은 연구자가 허용됩니다.

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An Analytical Tool that Quantifies Cellular Morphology Changes from Three-dimensional Fluorescence Images

우리는 단일 세포의 세 차원 공 촛점 형광에서 가져 정의되지 않은 형태의 형태학의 변화를 측정하기 Imaris 신경 과학, ImarisXT 및 MATLAB을 사용하는 소프트웨어 플랫폼을 개발했습니다. 이 새로운 접근 방식은 수용체 활성화에 따라 세포 모양의 변화를 수량화하는 데 사용되므로 약물 발견을위한 가능한 추가 도구를 나타냅니다 할 수 있습니다.

3 차원 형광 이미지에서 세포 형태학의 변경 사항 단정 지을 분석 도구

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for ...

an-analytical-tool-that-quantifies-cellular-morphology-changes-from

Research

JoVE Journal

Biology

14.5K 조회수.  University of California, San Francisco. 우리는 단일 세포의 세 차원 공 촛점 형광에서 가져 정의되지 않은 형태의 형태학의 변화를 측정하기 Imaris 신경 과학, ImarisXT 및 MATLAB을 사용하는 소프트웨어 플랫폼을 개발했습니다. 이 새로운 접근 방식은 수용체 활성화에 따라 세포 모양의 변화를 수량화하는 데 사용되므로 약물 발견을위한 가능한 추가 도구를 나타냅니다 할 수 있습니다.

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Chip-based Three-dimensional Cell Culture in Perfused Micro-bioreactors

We have developed a chip-based cell culture system for the three-dimensional cultivation of cells. The chip is typically manufactured from non-biodegradable polymers, e.g., polycarbonate or polymethyl methacrylate by micro injection molding, micro hot embossing or micro thermoforming. But, it can also be manufactured from bio-degradable polymers. Its overall dimensions are 0.7 1 x 20 x 20 x 0.7 1 mm (h x w x l). The main features of the chips used are either a grid of up to 1156 cubic micro-containers (cf-chip) each the size of 120-300 x 300 x 300 &mu; (h x w x l) or round recesses with diameters of 300 &mu; and a depth of 300 &mu; (r-chip). The scaffold can house 10 Mio. cells in a three-dimensional configuration. For an optimal nutrient and gas supply, the chip is inserted in a bioreactor housing. The bioreactor is part of a closed steril circulation loop that, in the simplest configuration, is additionaly comprised of a roller pump and a medium reservoir with a gas supply. The bioreactor can be run in perfusion, superfusion, or even a mixed operation mode. We have successfully cultivated cell lines as well as primary cells over periods of several weeks. For rat primary liver cells we could show a preservation of organotypic functions for more than 2 weeks. For hepatocellular carcinoma cell lines we could show the induction of liver specific genes not or only slightly expressed in standard monolayer culture. The system might also be useful as a stem cell cultivation system since first differentiation experiments with stem cell lines were promising.

We describe a chip-based platform for the three-dimensional cultivation of cells in micro-bioreactors. One chip can house up to 10 Mio. cells that can be cultivated under precisely defined conditions with regard to fluid flow, oxygen tension etc. in a sterile, closed circulation loop.

Perfused 마이크로 bioreactors의 칩 기반의 입체 세포 배양

We have developed a chip-based cell culture system for the three-dimensional cultivation of cells. The chip is typically manufactured from ...

연구

생물학

Microfabrication of Chip-sized Scaffolds for Three-dimensional Cell cultivation

Using microfabrication technologies is a prerequisite to create scaffolds of reproducible geometry and constant quality for three-dimensional cell cultivation. These technologies offer a wide spectrum of advantages not only for manufacturing but also for different applications. The size and shape of formed cell clusters can be influenced by the exact and reproducible architecture of the microfabricated scaffold and, therefore, the diffusion path length of nutrients and gases can be controlled.1 This is unquestionably a useful tool to prevent apoptosis and necrosis of cells due to an insufficient nutrient and gas supply or removal of cellular metabolites.
Our polymer chip, called CellChip, has the outer dimensions of 2 x 2 cm with a central microstructured area. This area is subdivided into an array of up to 1156 microcontainers with a typical dimension of 300 m edge length for the cubic design (cp- or cf-chip) or of 300 m diameter and depth for the round design (r-chip).2
So far, hot embossing or micro injection moulding (in combination with subsequent laborious machining of the parts) was used for the fabrication of the microstructured chips. Basically, micro injection moulding is one of the only polymer based replication techniques that, up to now, is capable for mass production of polymer microstructures.3 However, both techniques have certain unwanted limitations due to the processing of a viscous polymer melt with the generation of very thin walls or integrated through holes. In case of the CellChip, thin bottom layers are necessary to perforate the polymer and provide small pores of defined size to supply cells with culture medium e.g. by microfluidic perfusion of the containers.
In order to overcome these limitations and to reduce the manufacturing costs we have developed a new microtechnical approach on the basis of a down-scaled thermoforming process. For the manufacturing of highly porous and thin walled polymer chips, we use a combination of heavy ion irradiation, microthermoforming and track etching. In this so called "SMART" process (Substrate Modification And Replication by Thermoforming) thin polymer films are irradiated with energetic heavy projectiles of several hundred MeV introducing so-called "latent tracks" Subsequently, the film in a rubber elastic state is formed into three dimensional parts without modifying or annealing the tracks. After the forming process, selective chemical etching finally converts the tracks into cylindrical pores of adjustable diameter.

We present two processes for the microfabrication of porous polymer chips for three-dimensional cell cultivation. The first one is hot embossing combined with a solvent vapour welding process. The second one uses a recently developed microthermoforming process combined with ion track technology leading to a significant simplification of manufacture.

입체 세포 배양을위한 칩 크기의 공사장 공중 발판의 Microfabrication

Using microfabrication technologies is a prerequisite to create scaffolds of reproducible geometry and constant quality for three-dimensional cell ...

A high-throughput method to globally study the organelle morphology in S. cerevisiae

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help achieve an comprehensive understanding of molecular pathways. In Saccharomyces cerevisiae, with the development of the non-essential gene deletion array, we can globally study the morphology of different organelles like the endoplasmic reticulum (ER) and the mitochondria using GFP (or variant)-markers in different gene backgrounds. However, incorporating GFP markers in each single mutant individually is a labor-intensive process. Here, we describe a procedure that is routinely used in our laboratory. By using a robotic system to handle high-density yeast arrays and drug selection techniques, we can significantly shorten the time required and improve reproducibility. In brief, we cross a GFP-tagged mitochondrial marker (Apc1-GFP) to a high-density array of 4,672 nonessential gene deletion mutants by robotic replica pinning.  Through diploid selection, sporulation, germination and dual marker selection, we recover both alleles. As a result, each haploid single mutant contains Apc1-GFP incorporated at its genomic locus. Now, we can study the morphology of mitochondria in all non-essential mutant background. Using this high-throughput approach, we can conveniently study and delineate the pathways and genes involved in the inheritance and the formation of organelles in a genome-wide setting.

GFP-fusion proteins are widely used to visualize organelles by confocal microscopy. However, screening for mutations that affect the morphology of organelles generally requires individual mutagenesis and is time consuming. Here, we demonstrate a method to simultaneously incorporate organelle-GFP markers in almost 5,000 non-essential genes in yeast.

세계 S. cerevisiae의에서 organelle 형태를 연구하기 위해 높은 처리량 방법

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help ...

Assembly, Loading, and Alignment of an Analytical Ultracentrifuge Sample Cell

The analytical ultracentrifuge (AUC) is a powerful biophysical tool that allows us to record macromolecular sedimentation profiles during high speed centrifugation. When properly planned and executed, an AUC sedimentation velocity or sedimentation equilibrium experiment can reveal a great deal about a protein in regards to size and shape, sample purity, sedimentation coefficient, oligomerization states and protein-protein interactions.
This technique, however, requires a rigorous level of technical attention. Sample cells hold a sectored center piece sandwiched between two window assemblies. They are sealed with a torque pressure of around 120-140 in/lbs. Reference buffer and sample are loaded into the centerpiece sectors and then after sealing, the cells are precisely aligned into a titanium rotor so that the optical detection systems scan both sample and reference buffer in the same radial path midline through each centerpiece sector while rotating at speeds of up to 60, 000 rpm and under very high vacuum
Not only is proper sample cell assembly critical, sample cell components are very expensive and must be properly cared for to ensure they are in optimum working condition in order to avoid leaks and breakage during experiments. Handle windows carefully, for even the slightest crack or scratch can lead to breakage in the centrifuge. The contact between centerpiece and windows must be as tight as possible; i.e. no Newton s rings should be visible after torque pressure is applied. Dust, lint, scratches and oils on either the windows or the centerpiece all compromise this contact and can very easily lead to leaking of solutions from one sector to another or leaking out of the centerpiece all together. Not only are precious samples lost, leaking of solutions during an experiment will cause an imbalance of pressure in the cell that often leads to broken windows and centerpieces. In addition, plug gaskets and housing plugs must be securely in place to avoid solutions being pulled out of the centerpiece sector through the loading holes by the high vacuum in the centrifuge chamber. Window liners and gaskets must be free of breaks and cracks that could cause movement resulting in broken windows.
This video will demonstrate our procedures of sample cell assembly, torque, loading and rotor alignment to help minimize component damage, solution leaking and breakage during the perfect AUC experiment.

The analytical ultracentrifuge (AUC) sample cell holds sample and reference buffer and during experiments and is exposed to high vacuum and rotor speeds up to 60,000 rpm. This video will demonstrate the rigorous attention to detail necessary for assembly, loading and alignment of this very important component of an AUC experiment.

조립, 로딩 및 분석 초원 심 분리기 샘플 셀 정렬

The analytical ultracentrifuge (AUC) is a powerful biophysical tool that allows us to record macromolecular sedimentation profiles during high speed ...

Changes in Mammary Gland Morphology and Breast Cancer Risk in Rats

Studies in rodent models of breast cancer show that exposures to dietary/hormonal factors during the in utero and pubertal periods, when the mammary gland undergoes extensive modeling and re-modeling, alter susceptibility to carcinogen-induced mammary tumors. Similar findings have been described in humans: for example, high birthweight increases later risk of developing breast cancer, and dietary intake of soy during childhood decreases breast cancer risk. It is thought that these prenatal and postnatal dietary modifications induce persistent morphological changes in the mammary gland that in turn modify breast cancer risk later in life. These morphological changes likely reflect epigenetic modifications, such as changes in DNA methylation, histones and miRNA expression that then affect gene transcription . In this article we describe how changes in mammary gland morphology can predict mammary cancer risk in rats. Our protocol specifically describes how to dissect and remove the rat abdominal mammary gland and how to prepare mammary gland whole mounts. It also describes how to analyze mammary gland morphology according to three end-points (number of terminal end buds, epithelial elongation and differentiation) and to use the data to predict risk of developing mammary cancer.

Our protocol describes how to dissect the rat abdominal mammary gland and how to prepare mammary gland whole mounts. It also describes how to analyze mammary gland morphology using three end-points (number of terminal end buds, epithelial elongation and differentiation) and to use these results to predict mammary cancer risk in rats which were exposed to dietary modifications in utero or during prepuberty.

쥐에서 유선의 형태론과 유방암 위험의 변화

Studies in rodent models of breast cancer show that exposures to dietary/hormonal factors during the in utero and pubertal periods, when the mammary gland ...

Isolation of Mammary Epithelial Cells from Three-dimensional Mixed-cell Spheroid Co-culture

While enormous efforts have gone into identifying signaling pathways and molecules involved in normal and malignant cell behaviors1-2, much of this work has been done using classical two-dimensional cell culture models, which allow for easy cell manipulation. It has become clear that intracellular signaling pathways are affected by extracellular forces, including dimensionality and cell surface tension3-4. Multiple approaches have been taken to develop three-dimensional models that more accurately represent biologic tissue architecture3. While these models incorporate multi-dimensionality and architectural stresses, study of the consequent effects on cells is less facile than in two-dimensional tissue culture due to the limitations of the models and the difficulty in extracting cells for subsequent analysis.
The important role of the microenvironment around tumors in tumorigenesis and tumor behavior is becoming increasingly recognized4. Tumor stroma is composed of multiple cell types and extracellular molecules. During tumor development there are bidirectional signals between tumor cells and stromal cells5. Although some factors participating in tumor-stroma co-evolution have been identified, there is still a need to develop simple techniques to systematically identify and study the full array of these signals6. Fibroblasts are the most abundant cell type in normal or tumor-associated stromal tissues, and contribute to deposition and maintenance of basement membrane and paracrine growth factors7.
Many groups have used three dimensional culture systems to study the role of fibroblasts on various cellular functions, including tumor response to therapies, recruitment of immune cells, signaling molecules, proliferation, apoptosis, angiogenesis, and invasion8-15. We have optimized a simple method for assessing the effects of mammary fibroblasts on mammary epithelial cells using a commercially available extracellular matrix model to create three-dimensional cultures of mixed cell populations (co-cultures)16-22. With continued co-culture the cells form spheroids with the fibroblasts clustering in the interior and the epithelial cells largely on the exterior of the spheroids and forming multi-cellular projections into the matrix. Manipulation of the fibroblasts that leads to altered epithelial cell invasiveness can be readily quantified by changes in numbers and length of epithelial projections23. Furthermore, we have devised a method for isolating epithelial cells out of three-dimensional co-culture that facilitates analysis of the effects of fibroblast exposure on epithelial behavior. We have found that the effects of co-culture persist for weeks after epithelial cell isolation, permitting ample time to perform multiple assays. This method is adaptable to cells of varying malignant potential and requires no specialized equipment. This technique allows for rapid evaluation of in vitro cell models under multiple conditions, and the corresponding results can be compared to in vivo animal tissue models as well as human tissue samples.

A simple method is described for analyzing effects of tissue fibroblasts on associated epithelial cells. The combination of this method and three-dimensional tissue culture can facilitate analysis of cells after isolation from 3D. The technique is applicable to cells of varying malignant potential, allowing systematic study of effects of tumor-associated stroma on tumor cells.

세 가지 차원 혼합 셀 회전 타원체 공동 문화에서 Mammary 상피 세포의 분리

While enormous efforts have gone into identifying signaling pathways and molecules involved in normal and malignant cell behaviors1-2, much of this work ...

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized image analysis tools are available, most traditional image-analysis-based workflows have steep learning curves (for fine tuning of analysis parameters) and result in long turnaround times between imaging and analysis. In particular, cell segmentation, the process of identifying individual cells in an image, is a major bottleneck in this regard.
Here we present an alternate, cell-segmentation-free workflow based on PhenoRipper, an open-source software platform designed for the rapid analysis and exploration of microscopy images. The pipeline presented here is optimized for immunofluorescence microscopy images of cell cultures and requires minimal user intervention. Within half an hour, PhenoRipper can analyze data from a typical 96-well experiment and generate image profiles. Users can then visually explore their data, perform quality control on their experiment, ensure response to perturbations and check reproducibility of replicates. This facilitates a rapid feedback cycle between analysis and experiment, which is crucial during assay optimization. This protocol is useful not just as a first pass analysis for quality control, but also may be used as an end-to-end solution, especially for screening. The workflow described here scales to large data sets such as those generated by high-throughput screens, and has been shown to group experimental conditions by phenotype accurately over a wide range of biological systems. The PhenoBrowser interface provides an intuitive framework to explore the phenotypic space and relate image properties to biological annotations. Taken together, the protocol described here will lower the barriers to adopting quantitative analysis of image based screens.

Here we describe a workflow for rapidly analyzing and exploring collections of fluorescence microscopy images using PhenoRipper, a recently developed image-analysis platform.

신속한 분석 및 형광 현미경 이미지의 탐사

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly employ two-dimensional (2D) culture, which does not mimic the three-dimensional (3D) cellular microenvironment. A method to perform quenched emission FRET imaging using conventional widefield epifluorescence microscopy of cells within a 3D hydrogel environment is presented. Here an analysis method for ratiometric FRET probes that yields linear ratios over the probe activation range is described. Measurement of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP) levels is demonstrated in chondrocytes under forskolin stimulation using a probe for EPAC1 activation (ICUE1) and the ability to detect differences in cAMP signaling dependent on hydrogel material type, herein a photocrosslinking hydrogel (PC-gel, polyethylene glycol dimethacrylate) and a thermoresponsive hydrogel (TR-gel). Compared with 2D FRET methods, this method requires little additional work. Laboratories already utilizing FRET imaging in 2D can easily adopt this method to perform cellular studies in a 3D microenvironment. It can further be applied to high throughput drug screening in engineered 3D microtissues. Additionally, it is compatible with other forms of FRET imaging, such as anisotropy measurement and fluorescence lifetime imaging (FLIM), and with advanced microscopy platforms using confocal, pulsed, or modulated illumination.

F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) imaging is a powerful tool for real-time cell biology studies. Here a method for FRET imaging cells in physiologic three-dimensional (3D) hydrogel microenvironments using conventional epifluorescence microscopy is presented. An analysis for ratiometric FRET probes that yields linear ratios over the activation range is described.

3 차원 히드로 겔의 이미지를 FRET

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly ...

Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte precursors, immune cells, fibroblasts, blood vessels, and nerve projections. Although the molecular control of cell type specification and how these cells interact have been increasingly delineated, a more comprehensive understanding of these adipose-resident cells can be achieved by visualizing their distribution and architecture throughout the whole tissue. Existing immunohistochemistry and immunofluorescence approaches to analyze adipose histology rely on thin paraffin-embedded sections. However, thin sections capture only a small portion of tissue; as a result, the conclusions can be biased by what portion of tissue is analyzed. We have therefore developed an adipose tissue clearing technique, Adipo-Clear, to permit comprehensive three-dimensional visualization of molecular and cellular patterns in whole adipose tissues. Adipo-Clear was adapted from iDISCO/iDISCO+, with specific modifications made to completely remove the lipid stored in the tissue while preserving native tissue morphology. In combination with light-sheet fluorescence microscopy, we demonstrate here the use of the Adipo-Clear method to obtain high-resolution volumetric images&#160;of an entire adipose tissue.

Due to the high lipid content, adipose tissue has been challenging to visualize using traditional histological methods. Adipo-Clear is a tissue clearing technique that allows robust labeling and high-resolution volumetric fluorescent imaging of adipose tissue. Here, we describe the methods for sample preparation, pretreatment, staining, clearing, and mounting for imaging.

Adipo-지우기: 조직 지방 조직의 3 차원 이미징 방법 삭제

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte ...

Quantitative Approaches for Studying Cellular Structures and Organelle Morphology in Caenorhabditis elegans

Defining the cellular mechanisms underlying disease is essential for the development of novel therapeutics. A strategy frequently used to unravel these mechanisms is to introduce mutations in candidate genes and qualitatively describe changes in the morphology of tissues and cellular organelles. However, qualitative descriptions may not capture subtle phenotypic differences, might misrepresent phenotypic variations across individuals in a population, and are frequently assessed subjectively. Here, quantitative approaches are described to study the morphology of tissues and organelles in the nematode Caenorhabditis elegans using laser scanning confocal microscopy combined with commercially available bio-image processing software. A quantitative analysis of phenotypes affecting synapse integrity (size and integrated fluorescence levels), muscle development (muscle cell size and myosin filament length), and mitochondrial morphology (circularity and size) was performed to understand the effects of genetic mutations on these cellular structures. These quantitative approaches are not limited to the applications described here, as they could readily be used to quantitatively assess the morphology of other tissues and organelles in the nematode, as well as in other model organisms.

Quantitative Approaches for Studying Cellular Structures and Organelle Morphology in Caenorhabditis elegans

This study outlines quantitative measurements of synaptic size and localization, muscle morphology, and mitochondrial shape in C. elegans using freely available image processing tools. This approach allows future studies in&#160;C. elegans&#160;to quantitatively compare the extent of tissue and organelle structural changes as a result of genetic mutations.

예쁜꼬마선충의 세포구조와 세포세포형태를 연구하기 위한 정량적 접근법

Defining the cellular mechanisms underlying disease is essential for the development of novel therapeutics. A strategy frequently used to unravel these ...