Mitochondrial Isolation for Transmitochondrial Cybrid Generation

7일째에 약 2,500만 개의 미토콘드리아 기증자 세포가 확보되면 기하급수적으로 성장한 세포를 50밀리리터 튜브에서 수확하고 실온에서 520g을 5분 동안 원심분리하여 수집합니다. 차가운 인산완충식염수로 세포를 세척하고 5분 동안 실온에서 5분간 원심분리하여 침전시킨다. 이제 차가운 시약을 사용하여 섭씨 4도에서 전체 미토콘드리아 추출을 수행하고 세포 또는 미토콘드리아를 얼음 위에 보관하십시오.

3차 원심분리 후, 진공 펌프에 결합된 유리 피펫을 사용하여 흡인에 의해 상층액을 버리고, 세포 펠릿 부피의 7배에 해당하는 부피의 저장성 완충액에 충진된 세포를 재현탁한다. 그런 다음 세포 현탁액을 균질화 튜브로 옮기고 얼음에서 2분 동안 배양하여 세포가 부풀어 오르도록 합니다. 분당 600회 회전하는 모터 구동 유봉에 연결된 균질화기에서 8 내지 10번의 스트로크를 수행하여 세포막을 파괴합니다.

세포 균질액에 초기 펠릿 부피의 7배에 해당하는 저삼투압 완충액을 첨가하여 등장성 환경을 생성합니다. 균질액을 15 밀리리터 튜브로 옮기고 1, 000g 및 섭씨 4도에서 5 분 동안 고정 로터에서 원심 분리합니다. 그런 다음 상청액의 3/4 만 수집하고 펠릿에서 큰 여백을 남겨 핵 또는 손상되지 않은 세포로 오염되는 것을 방지하고 다른 튜브로 옮깁니다.

이 과정을 2회 반복한 후, 미토콘드리아 분획을 함유하는 상청액을 1.5-밀리리터 튜브로 옮긴다. 튜브를 섭씨 4도에서 2분 동안 최대 속도 18, 000g으로 원심분리합니다. 상등액을 버리고 미토콘드리아 농축 펠릿을 완충액으로 세척하십시오. A. 두 튜브의 내용물을 하나로 결합하고 이전에 시연 된대로 원심 분리합니다.

모든 재료가 하나의 튜브에 들어갈 때까지 이 과정을 반복합니다. 300 마이크로리터의 완충액을 사용하여 마지막 원심분리로부터 얻은 펠릿을 세척한다. A.Bradford 분석을 사용하여 미토콘드리아 단백질 농도를 정량화합니다. 미토콘드리아 수용자 세포주와 융합하기 전에 핵 단백질의 면역검출을 통해 미토콘드리아 분획에 핵 오염 물질이 없는지 평가합니다.

또는 핵 유전자의 정량적 중합효소 연쇄 반응 또는 QPCR 증폭을 수행합니다.