Preparation of Photo-Oxidized Outer Segment Tips and Fragments

폴리테트라플루오로에틸렌 또는 PTFE 코팅 슬라이드를 70% 에탄올에 10분 동안 생물 안전 캐비닛에 담가 멸균하는 것으로 시작합니다. 슬라이드를 멸균된 100mm 세포 배양 접시에서 자연 건조시킵니다. 각 슬라이드를 1개의 새로운 100mm 세포 배양 접시에 넣고 200마이크로리터의 혈청 함유 세포 배양 배지를 각 직사각형에 추가합니다.

그런 다음 전구가 슬라이드를 직접 향하도록 하여 휴대용 254나노미터 UV 광선을 100mm 세포 배양 접시에 놓고 20분 동안 놓습니다. 섭씨 37도의 수조에서 외부 세그먼트 또는 OS의 얼어붙은 부분 표본을 해동합니다. 그런 다음 실온에서 5 분 동안 2, 400G에서 OS를 회전시킵니다.

피펫을 사용하여 생물안전 캐비닛에서 상청액을 즉시 흡인하고 PBS에서 OS를 다시 일시 중단합니다. 이제, 슬라이드로부터 매체를 흡인하고, 각 슬라이드 직사각형 상에 2 x 10 내지 밀리리터당 8번째 OS PBS 용액의 2 x 10 내지 8번째 OS PBS 용액의 최대 500 마이크로리터를 배치한다. 전구가 OS를 직접 향하도록 하여 40분 동안 휴대용 254나노미터 UV 광선을 세포 배양 접시 위에 놓습니다.

1.5 밀리리터 튜브에 OS-PBS 용액을 수집합니다. 코팅된 슬라이드의 직사각형을 200 내지 500 마이크로리터의 PBS로 세척하고, 각각의 세척물을 마이크로원심분리 튜브에 수집한다. 그런 다음 OS-PBS 용액을 실온에서 5분 동안 2, 400G로 스핀다운합니다.

피펫터를 사용하여 생물안전 캐비닛에서 PBS를 흡인하고 망막 색소 상피 또는 RPE 배양에 사용할 표준 배지 500마이크로리터에 펠릿을 재현탁합니다. 10마이크로리터의 현탁액을 새 미세 원심분리기 튜브에 넣습니다. 더 많은 세포 배양 배지로 50-100 배 희석하고 혈구계로 OS를 계산합니다.

광산화된 OS 또는 OxOS 현탁액을 5.6 x 10 내지 밀리리터당 7번째 OS 농도로 표준 RPE 배지로 희석한다. OS 흡수 및 리포푸신 축적을 촉진하는 식균 작용 가교 리간드를 추가합니다. 그런 다음 OxOS를 일회용 스톡으로 분취하고 액체 질소에서 급속 동결합니다.

리포푸신 축적을 유도하기 위해 RPE 트랜스웰에 추가하기 전에 냉동된 분취액을 45마이크로리터의 세포 배양 배지에 희석하여 OxOS 분취액을 해동합니다. 그런 다음 컨포칼 현미경에서 Lambda 스캐닝을 사용하여 OxOS 방출 스펙트럼을 측정하여 산화된 OS를 특성화합니다. 공초점 영상은 처리된 OS가 처리되지 않은 OS에 비해 자가형광이 증가했음을 보여주었습니다.