형광 측정 측정을 위한 모든 획득 설정 구성 요소를 켭니다. 해리된 근육 섬유가 들어 있는 35mm 유리 바닥 접시를 현미경의 무대에 놓습니다. 조심스럽게 배양 배지를 1, 000 마이크로 리터 피펫으로 제거하고 2 밀리리터의 실온 링거 용액으로 교체하십시오.
기계식 또는 전동식 매니퓰레이터를 사용하여 두 개의 백금 와이어를 접시 바닥에 수직으로 놓습니다. 전극 단자가 섬유의 세로축을 기준으로 정렬되고 섬유 끝에서 몇 밀리미터 떨어져 있는지 확인하십시오. 접시를 회전시키거나 독립적인 마이크로 매니퓰레이터에 장착된 경우 각 전극을 이동하여 전극 위치를 조정합니다.
투과광을 켜고 20 X 대물렌즈를 사용하여 시야에서 광섬유를 찾습니다. EGFP 필터 큐브를 조명 경로로 이동합니다. 투과광을 끈 후 원격 제어 라이트 셔터를 사용하여 488나노미터 여기광을 활성화합니다.
EGFP 양극 광섬유를 식별하려면 가장 밝은 EGFP 신호가 있는 광섬유를 시야 중앙에 배치합니다. 여기광 경로에 위치한 다이어프램을 사용하여 여기광을 광섬유의 특정 영역에 집중시킵니다. 이를 통해 EGFP CaV1.1 신호가 최대인 신호 획득이 가능합니다.
기계식 스테이지로 광섬유 위치를 조정하여 다이어프램 광 경로에 정렬하고 광섬유 XY 위치를 저장합니다. 첫 번째 저장된 위치 파악으로 돌아간 후 두 개의 순차 자극 펄스의 지속 시간을 1밀리초로, 진폭을 20볼트로, 펄스의 극성을 교대로 설정합니다. 그런 다음 수동 트리거 스위치를 사용하여 두 개의 순차적 펄스를 전달합니다.
자극하는 동안 반대 극성의 두 펄스에 대한 반응으로 두 개의 동심원 균질 섬유 수축을 관찰하십시오. 교류 극성 펄스에서 수축이 없거나 동심원 수축이 하나만 관찰되는 경우 나머지 실험에서 섬유를 버립니다. 2 마이크로 리터의 10 밀리몰 MTS 5 TAMRA 용액을 접시에 직접 넣고 1, 000 마이크로 리터 피펫으로 부드럽게 혼합하십시오.
형광 티올 분자가 횡세뇨관 시스템 내로 확산될 수 있도록 4 내지 5분 동안 인큐베이션한다. 필드 자극을 통해 양극성 반복 자극을 적용하여 5분 동안 1초마다 300밀리초 동안 50헤르츠의 속도로 연속적인 활동 전위 열차를 유발합니다. 1, 000 마이크로 리터 피펫으로 접시에서 염색 용액을 제거하십시오.
그리고 2 밀리리터의 실온 링거 용액으로 교체하십시오. 염색된 섬유가 염색 프로토콜에서 최소 10분 동안 회복되도록 합니다. 두 개의 교대 펄스로 섬유 상태와 전기적 활동을 재평가한 후 MTS 5 TAMRA 필터 큐브를 광 경로로 옮기고 원격 제어 라이트 셔터로 533나노미터 여기 광을 활성화하여 섬유의 염색을 육안으로 확인합니다.
다음으로, 전동 스테이지에 저장된 위치를 사용하여 MTS 5 TAMRA 필터 큐브, 다이어프램 및 60X 오일 이멀젼 대물렌즈가 있는 필드 중앙에 광섬유를 배치합니다. 섬유의 양쪽 끝에서 계자 자극 백금 와이어의 방향을 바꾼 후 섬유의 주축에 있는 와이어를 직선으로 정렬하고 섬유를 중앙에 두고 5mm 간격으로 간격을 둡니다. 수집 소프트웨어에서 수집에 사용할 프로토콜을 선택합니다.
이 단계는 컴퓨터로만 제어되며 전기 자극 및 광 경로 셔터 제어를 위해 모든 다운스트림 장치를 트리거합니다. 각 프로토콜에 대해 신호 표백을 방지하기 위해 총 획득 시간을 최대한 최소화하되 기준선을 기록하기 위해 첫 번째 전기 자극 전에 수십 밀리초의 조명 및 신호 획득을 허용합니다. Execute(실행)를 눌러 프로토콜을 실행합니다.
녹음된 신호가 자동으로 화면에 표시됩니다. 신호의 작은 진폭과 광섬유의 빠른 기계적 수축은 종종 대부분의 신호를 숨기고 움직임 아티팩트를 표시합니다. 100 밀리몰의 1 마이크로 몰과 벤조일 파라 톨루엔 설폰 아미드를 기록 용액에 첨가하여 계약 반응을 최소화하고 섬유 활성화로 인한 S4 운동에서 발생하는 신호를 추가로 구별합니다.
몇 분 후에 동일한 프로토콜을 두 번 실행합니다. 이제 이동 아티팩트가 제거되었지만 S4 이동에 해당하는 작은 형광 변화가 남아 있습니다. 기계적 s를 사용하여 접시를 약간 움직입니다.tage 섬유나 파편이 없는 영역에서 신호를 수신합니다.
마지막으로 프로토콜을 실행하여 배경 형광을 기록합니다. 트레이스를 내보내고 스프레드시트 프로그램을 사용하여 신호를 시간의 함수로 f 0에 대한 델타 f로 표현하고 필요한 경우 기준선 보정을 적용합니다. EGFP CaV1.1 구축물을 발현하는 해부된 근육과 해리되지 않은 근육의 투과 및 형광 이미지의 예가 여기에 나와 있습니다.
MTS 5 TAMRA 염색 전후의 EGFP CaV1.1 VS D3 구축물을 발현하는 근섬유의 대표 이미지가 이 그림에 나와 있습니다. 이 염료는 또한 형질감염되지 않은 섬유의 내인성 시스테인을 염색합니다. EGFP CaV1.1 VS D3 구조체 및 MTS 5 TAMRA 염색의 컨포칼 이미지는 근섬유의 횡세뇨관 시스템에서 CaV1.1 국소화의 이중 밴드 패턴 특성을 보여줍니다.
두 개의 자극에 반응하고 포토 다이오드로 측정한 대표적인 형광 측정이 여기에 나와 있습니다. 두 신호 모두 최소값으로 정규화되고 각각의 탈분극에 대한 시간 함수로 표시됩니다. 이러한 기록은 신호의 상승 위상과 피크까지의 시간이 광섬유에 부과된 두 탈분극에 대해 유사하다는 것을 보여줍니다.
