멀티플렉스 면역형광염색 전에, 조직을 고정하고 탈파라핀화 및 내인성 퍼옥시다아제 억제를 수행한다. 그런 다음 다중 면역형광 염색을 위해 0.1% Triton X-100으로 보완된 10밀리몰 구연산염 완충액이 들어 있는 300밀리리터 염색 용기에 슬라이드를 담갔습니다. 완충액이 끓기 시작할 때까지 뚜껑을 닫은 채 염색 용기를 전자레인지에 최대 전력으로 3-5분 동안 넣습니다.
끓인 후 전자레인지를 15분 동안 저전력으로 올려 버퍼를 거의 끓는 온도에 둡니다. 다시 말하지만, 전자레인지를 90초 동안 최대 전력으로 설정하여 버퍼를 가열합니다. 전자레인지에서 병을 꺼내고 버퍼를 실온에서 15분 동안 식힙니다.
슬라이드를 증류수로 각각 5분 동안 3회 헹구고, 0.1% 트윈 20 또는 TBS 트윈을 함유한 트리스 완충 식염수로 5분간 헹굽니다. 마지막 세척 후 슬라이드를 종이 타월로 닦아서 TBS 트윈을 제거합니다. 그런 다음 슬라이드를 현미경 슬라이드 상자에 놓고 소수성 펜으로 조직을 둘러쌉니다.
TBS Tween에 용해된 5% BSA로 조직을 덮어 비특이적 결합 부위를 차단합니다. 30분 후, 슬라이드를 종이 타월로 블로핑하여 블로킹 버퍼를 제거합니다. 다음으로, 1% BSA, TBS 트윈에 희석된 300마이크로리터의 1차 항체로 조직을 60분 동안 배양합니다.
배양 후, 슬라이드를 TBS 트윈으로 각각 3분 동안 3회 헹구었다. 세척 후 300 마이크로리터의 Poly-HRP 2차 항체로 조직을 40분 동안 배양합니다. 배양 후, 슬라이드를 TBS 트윈으로 각각 3분 동안 3회 헹구었다.
다음으로, 0.003% 과산화수소로 즉석에서 보충된 붕산염 완충액에 200배 희석된 300마이크로리터의 형광색소 티라미드 시약으로 10분 동안 조직을 배양합니다. 그런 다음 TBS 트윈으로 슬라이드를 세 번 헹구고 1% BSA, TBS 트윈으로 희석된 인간 범-사이토케라틴 항체로 섭씨 4도에서 밤새 조직을 배양합니다. 다음날, TBS 트윈으로 조직을 헹구고, 1%BSA, TBS 트윈에 200배 희석한 형광색소와 직접 결합된 2차 항체로 120분 동안 배양한다.
배양 후, TBS 트윈으로 조직을 헹구고 10% BSA, TBS 트윈에서 1, 000배 희석한 비스벤지미드로 핵을 염색하기 전에 5분 동안 배양합니다. 형광 장착 매체와 붕규산 커버 글라스를 사용하여 슬라이드에 장착하기 전에 증류수에서 각각 3분 동안 조직을 3회 헹굽니다. 이미지 분석을 위해 스캔을 이미지 분석 소프트웨어로 가져옵니다.
그런 다음 Analysis(분석) 탭으로 이동하고 Settings(설정), Actions(작업), Load(로드)를 차례로 클릭하여 high-plex 형광 알고리즘을 선택합니다. 염료 선택(Dye Selection) 탭과 관심 있는 염료를 선택합니다. Nuclear Detection(핵 탐지) 탭에서 Nuclear Segmentation Type(핵 분할 유형)으로 이동하여 AI Custom(AI 사용자 지정)을 선택합니다.
그런 다음 핵 분할 분류기(Nuclear Segmentation Classifier)에서 멤브레인 및 세포질 검출(Membrane and Cytoplasm Detection) 탭 AI.In 저장된 훈련된 항목을 선택하고 최대 세포질 반경과 멤브레인 염료 수를 선택합니다. 각 염료에 대해 핵 양성 역치, 세포질 양성 역치 및 막 양성 역치를 선택합니다. 각 염료에 대해 핵, 막 및 세포질 완전성 백분율 값을 선택합니다.
Settings(설정), Actions(작업) 및 Save(저장)를 선택하여 알고리즘을 저장합니다. 분석(Analyze)을 클릭하고 주석 레이어(Annotation Layer)를 선택하여 관심 영역을 분석합니다. 그런 다음 결과 탭으로 이동하여 개체 데이터에서 모든 데이터를 선택합니다.
내보내기를 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 objectdata.csv를 선택하여 CSV 형식으로 데이터를 내보냅니다. 멀티플렉스 면역형광법에 의한 최적 염색의 대표적인 결과가 나타나 있다. 항체 특이성을 검증하고 염색의 신호 대 잡음비를 최적화하기 위해서는 올바른 희석액을 선택하는 것이 필수적이었습니다.
