멸균 마이크로 원심분리 튜브 1에서 200마이크로리터의 환원된 혈청 배지와 2마이크로그램의 플라스미드 DNA를 개별적으로 혼합하는 것으로 시작합니다. 별도의 튜브에 있는 두 개의 다른 플라스미드에 대해 이 작업을 반복합니다. 그런 다음 새로운 튜브 2에서 200 마이크로리터의 환원된 혈청 배지와 6 마이크로리터의 형질주입 시약을 혼합하고 피펫팅으로 내용물을 혼합합니다.
튜브 2의 내용물을 튜브 1에 혼합하기 전에 실온에서 5분 동안 튜브를 배양합니다. 별도의 튜브에서 다른 2개의 플라스미드를 형질주입 시약과 혼합하는 것을 반복합니다. 혼합물을 실온에서 20분 동안 인큐베이션한다.
다음으로, 적하하여 형질주입 복합체를 HeLa 세포 배양 시드 이미징 접시에 추가하여 전체 접시에 균등하게 분포되도록 합니다. 이미징 1시간 전에 이산화탄소 탱크 밸브를 열고 현미경용 환경 컨트롤러를 켭니다. 터치패드의 위쪽 및 아래쪽 화살표를 사용하여 온도를 섭씨 37도로 조정하고 이산화탄소를 5%완료되면 설정을 누릅니다.
레이저 설정을 조정하려면 Acquire(획득) 탭을 클릭하고 Open Laser Overview(레이저 개요 열기)를 선택하여 백색광 레이저를 켭니다. 대화 상자에서 백색광 레이저를 켜기로 전환합니다. 레이저 출력을 85%로 입력여기 제어 버튼을 클릭하고 드롭다운 메뉴에서 최대 출력을 선택합니다.
테트라에틸 로다민 에틸 에스테르 퍼콜레이트 또는 TMRE를 시작하고, 여기 레이저를 514 나노미터로 설정하고 YFP에 대해 방출 스펙트럼 창을 524 내지 545 나노미터로 설정하여 실험을 시작한다. 다음으로, MitoTracker Deep Red의 경우, 여기 레이저를 641로 설정하고 방출 스펙트럼 창을 650에서 750 나노미터로 설정한다. 마찬가지로 TMRE의 경우 여기 레이저를 555 나노 미터로 설정하고 방출 스펙트럼 창을 557에서 643 나노 미터로 설정합니다.
획득 탭을 선택하고 형식을 1024 x 1024로 조정하여 이미지 획득 설정을 시작합니다. 드롭다운 메뉴에서 속도를 600으로 조정합니다. 그런 다음 Line Average 버튼을 클릭하고 드롭다운 메뉴에서 세 가지를 선택합니다.
양방향 스캔을 켜고 위상 및 확대/축소 비율을 각각 22.61 및 1.50으로 설정합니다. 완료되면 YFP 설정 1을 클릭하고 Fast Live를 눌러 YFP 형광 신호를 기반으로 셀을 선택합니다. 그런 다음 YFP의 이득과 강도를 조정한 다음 YFP 형광 신호를 기반으로 셀을 선택합니다.
TMRE 실험에서 DMSO 제어판을 이미지화하려면 미토콘드리아 네트워크 강도가 포화 바로 아래에 있도록 TMRE 신호 설정 2의 이득과 강도를 조정합니다. TMRE의 게인과 강도를 일정하게 유지합니다. 그런 다음 MitoTracker 설정의 게인과 강도를 조정하여 미토콘드리아 네트워크가 보이지만 어둡도록 합니다.
게인 및 강도 설정이 완료되면 시작을 클릭하여 이미지를 획득합니다. 실험 조건당 20개 세포의 이미지를 획득합니다.
