0.5g의 ORO 분말을 이소프로판올 100밀리리터에 용해시켜 원액을 생성하여 ORO 용액을 준비합니다. ORO 원액과 탈이온수를 60:40 비율로 결합하여 모든 근육에 대한 작업 용액을 준비합니다. 미립자가 가라앉을 수 있도록 작업 용액을 10분 동안 덮습니다.
40마이크로미터 메쉬를 통해 여과한 다음 0.22마이크로미터 주사기 필터를 통해 여과합니다. 다음으로, 웰 플레이트의 탈세포 근육에서 포름 알데히드 용액을 제거하고 동일한 양의 PBS로 근육을 세 번 세척합니다. 그런 다음 PBS를 동일한 부피의 60% 이소프로판올 용액으로 교체하고 흔들리는 셰이커에서 5분 동안 배양합니다.
완료되면 60 % 이소프로판올 용액을 로킹 셰이커에서 10 분 동안 배양하기 전에 ORO 작업 용액으로 교체하십시오. 다음으로, ORO 작업 용액을 동일한 부피의 1% SDS로 교체하고 SDS 용액을 주기적으로 검사합니다. 용액이 눈에 띄게 분홍색이 되면 SDS 용액을 새로운 1% SDS로 교체합니다.
용액이 24시간 동안 깨끗하게 유지되면 1%SDS를 PBS로 교체합니다. 4배 배율의 실체 현미경으로 염색된 근육 외부에 붙어있는 명백한 파편이나 미립자를 제거합니다. 염색이 만족스러우면 투명한 매트릭스에 떠 있는 밝은 빨간색 구체를 표시하고 실체 현미경에 부착된 카메라를 사용하여 염색 이미지를 획득합니다.
적절하게 탈세포화된 근육은 하얗고 반투명했다. 탈세포화된 근육을 근육 내 지방 조직(IMAT)을 시각화하기 위해 ORO로 염색했을 때 IMAT 지질 방울이 투명한 근육 구조 내에서 빨간색 구체로 나타났습니다. 건강한 쥐 뒷다리 근육은 심장 독소 또는 글리세롤을 주입한 뒷다리 근육에 비해 적색 또는 양성 지질이 거의 또는 전혀 없는 것으로 입증된 약간의 자연적인 IMAT를 보여주었습니다.
불완전한 탈세포화는 초기 SDS 처리 직후 또는 ORO 염색 후 반불투명 연분홍색 섬유로 확인되었습니다. 불완전한 ORO 클리어런스는 ORO 세척 후 뚜렷한 섬유 선이 아닌 분홍색 또는 빨간색의 균일한 배경으로 확인되었습니다.
