염색된 IMAT 지질 액적 메트릭의 정량화를 시작하려면 ImageJ에서 Confocal Stacks를 엽니다. Image(이미지), Adjust(조정), Threshold(임계값)를 차례로 선택하여 Threshold User Interface(임계값 사용자 인터페이스)를 엽니다. 사용자 인터페이스에서 임계값 설정으로 Intermodes(인터모드)를 선택하고 Dark Background(어두운 배경)가 선택되어 있는지 확인합니다.
그런 다음 Apply(적용)를 클릭하여 임계값 알고리즘을 실행합니다. Watershed 알고리즘을 실행하여 Process(프로세스), Binary(이진) 및 Watershed(워터셰드)를 선택하여 접촉하는 지질 방울을 분리합니다. 대화 상자에서 [예]를 선택하면 스택의 모든 이미지가 처리되어 흰색으로 단색된 더 넓은 영역을 나누는 얇은 검은색 선을 추가할 수 있습니다.
최대 및 최소 입자 크기를 설정하려면 원본 이미지를 열고 타원형 도구를 사용하여 보기에서 가장 작은 지질 방울과 가장 큰 지질 방울의 윤곽을 그립니다. 그런 다음 T.Select Analyze를 입력한 다음 Set Measurements를 입력하여 이러한 형상을 ROI Manager에 추가합니다. 대화 상자에서 설정을 선택하고 영역만을 선택한 다음 확인을 클릭합니다. 그런 다음 ROI 관리자에서 측정을 선택합니다.
이 결과 창의 두 영역 측정값을 크기 범위로 사용하고 입자를 분석합니다. 입자 분석 알고리즘으로 관심 영역(ROI)을 식별합니다. Analyze(분석)를 선택한 다음 Analyze Particles(입자 분석)를 선택합니다.
선택 설정을 지정할 수 있는 대화상자가 열립니다. ROI 측정값을 출력하려면 분석(Analyze)을 선택한 다음 측정 설정(Set Measurements)을 선택하고 영역(Area), 중심(Centroid), 타원 피팅(Fit Ellipse) 및 스택 위치(Stack Position)를 선택합니다. 확인을 클릭합니다. 그런 다음 ROI 관리자에서 측정을 선택합니다.
결과 테이블의 데이터를 선택하고 추가 분석을 위해 Excel로 복사할 수 있습니다. 개별 지질 액적 측정 및 분포에 대한 자세한 평가를 위해 BODIPY 형광 표지 지질 액적을 컨포칼 현미경을 통해 이미지화했습니다. 임계값 설정 및 형상 분할은 각 지질 방울에 대한 ROI를 생성하기 위한 좋은 첫 번째 단계를 제공했습니다.
그러나 오류를 수정하기 위해 수동 편집이 필요했습니다. 이미지에서 희미하게 보이는 깊은 지질 방울은 ImageJ의 타원형 도구를 사용하여 손으로 추가할 수 있습니다. 단일 ROI로 잘못 식별된 지질 방울 그룹은 원래 ROI를 삭제하고 여러 개의 새로운 ROI로 대체하여 수정할 수도 있습니다.
단일 지질 방울이 여러 절편에서 고유한 ROI로 식별된 경우, 중복된 ROI는 단일 ROI로 통합되었습니다.
