부착성 원료 264.7이 들어 있는 플레이트에서 배지를 흡인하는 것으로 시작합니다. 15 센티미터 플레이트 당 10 밀리리터의 PBS를 추가하십시오. 셀 스크레이퍼를 사용하여 셀을 분리하고 단일 50밀리리터 튜브로 당깁니다.
균질화하기 위해 세포 현탁액을 위아래로 피펫팅합니다. 다음으로, 세포 현탁액 부피의 5%를 새로운 1.5밀리리터 튜브로 옮깁니다. 실온에서 5분 동안 300G에서 원심분리합니다.
상층액을 버리고 전체 세포 분획 펠릿을 얼음 위에 놓습니다. 앞서 기술한 바와 같이 나머지 현탁액을 원심분리한 후, 상청액을 흡인하고, 세포 펠릿을 5밀리리터의 얼음처럼 차가운 미토콘드리아 완충액에 재현탁시킨다. 섭씨 4도에서 5분 동안 300G에서 현탁액을 원심분리합니다.
펠릿을 0.5 밀리리터의 차가운 미토콘드리아 완충액에 다시 현탁시킵니다. 그리고 현탁액을 1.5 밀리리터 튜브로 옮깁니다. 다음으로, 현탁액을 균질화하여 1 밀리리터 주사기에 장착 된 25 게이지 바늘을 통해 30 회 우회합니다.
그런 다음 1 밀리리터의 차가운 미토콘드리아 완충액을 튜브에 넣고 반전으로 혼합합니다. 세포를 원심 분리 한 후, 상청액 1 밀리리터를 얼음 위의 신선한 튜브로 옮긴다. 펠릿을 완충액에 다시 현탁하고 1밀리리터 주사기에 장착된 25게이지 바늘을 통과시켜 펠릿을 균질화합니다.
균질화된 세포 펠릿과 이전 단계의 상청액을 단일 1.5밀리리터 튜브로 당깁니다. 섭씨 4도에서 5 분 동안 2, 000G에서 원심 분리합니다. 상청액을 모아 4 개의 1.5 밀리리터 튜브로 나눕니다.
미토콘드리아 완충액을 사용하여 각 튜브의 부피를 1.5 밀리리터로 구성하십시오. 튜브를 뒤집어 내용물을 섞은 다음 튜브를 원심분리합니다. 상층액과 상부 흰색 세포 펠릿을 조심스럽게 제거합니다.
갈색 미토콘드리아 펠릿이 들어 있는 4개의 튜브 중 하나를 미토콘드리아 분획으로 얼음 위에 보관하십시오. 남은 펠릿을 새 튜브로 당기고 미토콘드리아 완충액으로 최종 부피를 1밀리리터로 만듭니다. 이 프로토콜을 사용하여, 총 세포 및 미토콘드리아 분획을 원시 264.7 대식세포 세포주 및 BMDM으로부터 수득하였다.
면역 혈액 분석은 미토콘드리아 구연산염 합성 효소가 조 분획에서 농축되었음을 보여주었습니다. 세포질, 원형질막, 핵, 리소좀 및 소포체의 단백질이 사라졌습니다. 프로테옴 분석은 조 분율에서 10배 이상의 농축을 보여주었다.
다른 6개의 세포 구획은 정제 중에 고갈되었습니다.
